Dokument: Die Rolle des thrombozytären Pannexin 1 Kanals in der Thrombose, der Hämostase und der Entwicklung von abdominalen Aortenaneurysmen
| Titel: | Die Rolle des thrombozytären Pannexin 1 Kanals in der Thrombose, der Hämostase und der Entwicklung von abdominalen Aortenaneurysmen | |||||||
| Weiterer Titel: | The role of the platelet pannexin 1 channel in thrombosis, hemostasis and the development of abdominal aortic aneurysms | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=61695 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20230116-084505-2 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Metz, Lisa [Autor] | |||||||
| Dateien: |
| |||||||
| Beitragende: | Prof. Dr. Fahlke, Christoph [Gutachter] Prof. Dr. Elvers, Margitta [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die durch Thrombozyten vermittelte primäre Hämostase ist ein wichtiger Prozess, da unkontrollierte Thrombusbildung zu einem Gefäßverschluss und damit zu kardiovaskulären Ereignissen wie z. B. einer Thrombose, führen kann. Pannexin 1 (PANX1) ist ein transmembranes Protein, welches ubiquitär in Säugetieren exprimiert wird, unter anderem auf humanen und murinen Thrombozyten. Strukturell sind PANX1 Kanäle aus vier Transmembran-Domänen aufgebaut, welche als Hexamer auf der Plasmamembran funktionsfähige Ionenkanäle mit einer hohen Leitfähigkeit für Adenosintriphosphat (ATP) Moleküle aufweisen, die wichtige Signalmoleküle in der Thrombozytenaktivierung darstellen.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass der ITAM gekoppelte Signalweg durch Kollagenrezeptor Glykoprotein (GP)VI eine essenzielle Rolle in der PANX1 Aktivierung spielt. Pharmakologische Inhibition des humanen PANX1 Kanals mittels Probenecid als auch Analyse von PANX1 defizienten murinen Thrombozyten zeigten eine verminderte ATP Freisetzung und eine verringerte Thrombozytenaggregation nach Stimulation des GPVI vermittelten Signalweges. In einem ex vivo Flusskammerversuch unter dynamischen arteriellen Bedingungen führte eine thrombozyten-spezifische PANX1 Deletion als auch eine Inhibierung von PANX1 mittels Probenecid und Carbenoxolone zu einer verringerten Thrombusbildung bei geringen und intermediären arteriellen Scherraten auf einer mit Kollagen beschichteten Matrix. Detaillierte Untersuchungen zu Aktivierungsmechanismen des PANX1 Kanals mittels Western Blot Analysen demonstrieren, dass eine Stimulation mit klassischen Agonisten zu einer erhöhten Phosphorylierung von PANX1 an Tyr198 führte, welche nach Inhibierung der Src-Kinase-Familie (SFK) verringert war. Dabei wurde mit Hilfe von GPVI defizienten Thrombozyten dieser als zentraler Rezeptor für die Kollagen-induzierte PANX1 Tyr198 Phosphorylierung identifiziert. Interessanterweise führte eine Thrombozyten Aktivierung über purinerge Rezeptoren nicht zu einer Phosphorylierung von PANX1 an Tyr198, sondern an Tyr308, einer weiteren bekannten zur PANX1 Aktivierung beitragenden Phosphorylierungsstelle. Inhibierung von SFK zeigte, dass diese nur an der GPVI –vermittelten Phosphorylierung von PANX1 Tyr308 beteiligt sind, was auf weitere Aktivierungsmechanismen der PANX1 Kanäle hinweist. Inhibierungsversuche der Kinasen PKC und PKB lassen auf eine untergeordnete Rolle dieser in der PANX1 Aktivierung schließen. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit die Rolle des PANX1 Kanals in der Entstehung und Entwicklung abdominaler Aortenaneurysmen (AAA) untersucht. Patienten mit AAA zeigten einen erhöhten PANX1 Plasmaspiegel als auch eine verringerte Phosphorylierung des thrombozytären PANX1 Kanals an Tyr198 nach Stimulation des GPVI Signalweges. Um die Rolle des thrombozytären PANX1 Kanals in dem Krankheitsbild des AAA detaillierter analysieren zu können, wurden Mäuse mit (Panx1 fl/fl PF4-Cre+) und ohne (Panx1 fl/fl PF4-Cre-) einer PANX1 Deletion auf Thrombozyten in einem wissenschaftlich anerkannten in vivo Mausmodell der Aneurysmainduktion mit „Porciner Pankreas-Elastase“ (PPE) 3, 7, 14 und 28 Tage nach PPE Operation untersucht. Eine Deletion des PANX1 Kanals veränderte den Aortendiameter auch 28 Tage nach PPE Operation nicht, allerdings zeigte sich nach 14 Tagen eine verringerte Anzahl zirkulierender Thrombozyten und Erythrozyten. Dies ging mit einer verminderten Aktivierung sowie prokoagulanten Oberfläche der Thrombozyten einher, während die Oberflächenexpression der untersuchten Glykoproteine 3, 7, 14 und 28 Tage nach PPE Operation unverändert blieb. Außerdem führte eine PANX1 Deletion auf Thrombozyten zu einer verringerten Bildung zirkulierender Thrombozyten-Neutrophilen Aggregaten sowie einer verringerten Anzahl migrierter Thrombozyten und Neutrophilen in das Aortengewebe ausschließlich 14 Tage nach PPE Operation. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Dissertation, dass PANX1 Kanäle als ATP Freisetzungskanäle in Thrombozyten fungieren, die durch Veränderung der Thrombozytenfunktion in der Bildung arterieller Thromben eine entscheidende Rolle spielen. Die Aktivierung von PANX1 wird durch Phosphorylierung an Tyr198 und Tyr308 reguliert, wobei der GPVI-Src Signalweg eine zentrale Rolle spielt. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse auf eine wichtige Rolle des PANX1 Kanals bei der Zell-Zell-Interaktion mit Neutrophilen in der AAA Progression hin.Platelet-mediated primary hemostasis is an important process because uncontrolled thrombus formation can lead to vascular occlusion and consequent cardiovascular events such as thrombosis. Pannexin 1 (PANX1) is a transmembrane protein that is ubiquitously expressed in mammals, including on human and murine platelets. Structurally, PANX1 channels are composed of four transmembrane domains, which build functional ion channels as hexamers on the plasma membrane with a high conductance for adenosine triphosphate (ATP), which is an important signaling molecule in platelet activation. In the present work, the ITAM-coupled signaling pathway through collagen receptor glycoprotein (GP)VI was shown to play an essential role in PANX1 activation. Pharmacological inhibition of the human PANX1 channel by probenecid as well as analysis of PANX1 deficient murine platelets showed decreased ATP release and platelet aggregation after stimulation of the GPVI-mediated signaling pathway. In a thrombus formation assay ex vivo, platelet specific PANX1 deletion as well as inhibition of PANX1 using probenecid and carbenoxolone resulted in decreased thrombus formation at low and intermediate arterial shear rates on a collagen coated matrix. Detailed studies of PANX1 channel activation mechanisms by Western blot analysis demonstrate that stimulation with classical agonists resulted in increased phosphorylation of PANX1 at Tyr198, which was decreased after inhibition of Src kinase family (SFK). Thereby, GPVI was identified as a central receptor for collagen induced PANX1 Tyr198 phosphorylation using platelets from Gp6-/- mice. Interestingly, platelet activation via purinergic receptors did not result in phosphorylation of PANX1 at Tyr198 but at Tyr308, another known phosphorylation site contributing to PANX1 activation. Inhibition of SFK showed that they are only involved in GPVI mediated phosphorylation of PANX1 Tyr308, suggesting further activation mechanisms of PANX1 channels in platelets. Inhibition experiments of the kinases PKC and PKB suggested a minor role of these in PANX1 activation displayed by Western blots analysis. Furthermore, the role of PANX1 channel in the formation and development of abdominal aortic aneurysms (AAA) was investigated in this work. Patients with AAA showed increased plasma PANX1 levels as well as decreased phosphorylation of the platelet PANX1 channel at Tyr198 after stimulation of the GPVI signaling pathway. To analyze in more detail the role of the platelet PANX1 channel in the clinical picture of AAA, mice with (Panx1 fl/fl PF4-Cre+) and without (Panx1 fl/fl PF4-Cre-) a PANX1 deletion on platelets were studied in a scientific approved in vivo mouse model of aneurysm induction with "Porcine Pancreatic Elastase" (PPE) at 3, 7, 14, and 28 days after PPE surgery. Deletion of platelet PANX1 channels did not alter the aortic diameter 28 days after PPE surgery; however, at 14 days, the number of circulating platelets and erythrocytes was decreased. This was associated with reduced activation and procoagulant surface of platelets, whereas surface expression of the analyzed glycoproteins remained unchanged 3, 7, 14 and 28 after PPE surgery. Furthermore, PANX1 deletion on platelets resulted in decreased formation of circulating platelet-neutrophil aggregates as well as decreased numbers of migrated platelets and neutrophils into aortic tissue exclusively 14 days after PPE surgery. In summary, the results of this dissertation demonstrate that PANX1 channels function as ATP release channels in platelets that play a critical role in arterial thrombus formation by altering platelet functions. Activation of PANX1 is regulated by phosphorylation at Tyr198 and Tyr308, with the GPVI-Src signaling pathway playing a central role. Furthermore, the results suggest an important role of the PANX1 channel in cell-cell interaction with neutrophils in the progression of AAA. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 16.01.2023 | |||||||
| Dateien geändert am: | 16.01.2023 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 29.06.2022 | |||||||
| Datum der Promotion: | 11.01.2023 |
