Dokument: Production of chiral amino alcohols and diamines in a biocatalytic (cascade) process

Titel:	Production of chiral amino alcohols and diamines in a biocatalytic (cascade) process
Weiterer Titel:	Die Produktion von chiralen Aminoalkoholen und Diaminen in einem biokatalytischen (Kaskaden-)Prozess
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=61622
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20230110-105933-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Seide, Selina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,37 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.01.2023 / geändert 05.01.2023
Beitragende:	PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter] Prof. Dr. Pietruszka, Jörg [Gutachter]
Stichwörter:	KDOs, LDCs, hydroxy-L-lysine, hydroxy-cadaverine, Cadaverine, Putrescine, cascade reactions, biocatalytic process development, alpha-ketoglutarate dependent deoxygenates, lysine decarboxylates, amino acid analytics, HaloTag Immobilization, ziG Immobilization, Enzyme Immobilization
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Chemically, C-H functionalization is difficult because carbon-hydrogen bonds are relatively inert. Consequently, limitations in chemo-, regio- and stereo control occur, as conventional organic synthesis requires extensive protection group chemistry. Fe(II)/α-ketoglutarate-dependent dioxygenases (KDOs) provide an excellent synthesis alternative, as they catalyze selective C–H oxidation reactions. However, recombinantly produced KDOs are predominantly formed as catalytically inactive inclusion bodies or precipitate upon purification. Further, they are unstable under oxidative conditions. As a result, their use is limited in preparative biotransformations. Three different KDOs were evaluated in this study for their potential application in a preparative lab scale. They catalyze the stereoselective hydroxylation of the L-lysine side chain in 3-position (CaKDO from Catenulispora acidiphila) and 4-position (CpKDO from Chitinophaga pinensis or FjKDO from Flavobacterium johnsoniae). This thesis aims to optimize process bottlenecks by increasing the soluble production of the enzymes and implementing an in-situ immobilization for improved enzyme stability and recyclability. Covalent immobilization of the KDOs via the HaloTag® resulted in a strong increase in stability for CaKDO. Upon immobilization of all three KDOs, the increase in stability enabled substrate conversion of > 200 mM L-lysine. Further, enzyme recycling was possible in an analytical scale for FjKDO and CpKDO for four batches with conversions of 100% and 84%, respectively, thereby effectively increasing the space-time yields. Further, immobilized CaKDO-HaloTag® and FjKDO-HaloTag® were applied in a preparative lab-scale (15 mL) with 16 g L-1 product titers and specific space-time-yields of 73.4 gproduct L−1 h−1 per gimmobilized CaKDO and 133.65 gproduct L−1 h−1per gimmobilized FjKDO, respectively. Using a HaloTag®-immobilized lysine decarboxylase from Selenomonas ruminantium (SrLDC), the (3S)-hydroxy-L-lysine from the CaKDO-catalyzed reaction was successfully decarboxylated to (2S)-hydroxy-cadaverine without intermediate product purification, yielding a product titer of 11.6 g L−1 in a 15 mL consecutive batch reaction. The absence of metabolic background of whole cells or cell-free extracts enabled a successful product purification.   Chemisch ist eine C-H-Funktionalisierung schwierig, da Kohlenstoff-Wasserstoffbindungen relativ träge sind. Dazu kommt es zu Einschränkungen bei der Chemo-, Regio- und Stereoselektivität mit Methoden der herkömmlichen organischen Synthese, die zumeist nur durch umfangreiche Schutzgruppenchemie realisiert werden kann. Fe(II)/α-Ketoglutarat-abhängige Dioxygenasen (KDOs) bieten eine hervorragende Synthesealternative, da sie ein breites Spektrum selektiver C-H-Oxidationsreaktionen katalysieren. KDOs werden allerdings zum großen Teil als inaktive Einschlusskörper produziert, fallen bei der Reinigung aus und sind unter oxidativen Bedingungen instabil, sodass ihre Verwendung in präparativen Biotransformationen begrenzt ist. In dieser Dissertation wurden drei verschiedene KDOs auf ihre mögliche Anwendung im präparativen Labormaßstab untersucht. Sie katalysieren die stereoselektive Hydroxylierung der L-Lysin Seitenketten in 3-Position (CaKDO aus Catenulispora acidiphila) und 4-Position (CpKDO aus Chitinophaga pinensis oder FjKDO aus Flavobacterium johnsoniae). Ziel dieser Arbeit war die Optimierung von Prozessengpässen durch die Steigerung der löslichen Enzym Produktion sowie die Immobilisierung der Enzyme direkt aus dem Rohzellextrakt zur Erhöhung der Enzymstabilität und zur Wiederverwendung. Die kovalente HaloTag® -Immobilisierung der KDOs führte zu einer signifikanten Erhöhung der Stabilität der CaKDO. Nach der Immobilisierung aller drei KDOs ermöglichte die erhöhte Stabilität einen Substratumsatz von > 200 mM L-Lysin. Darüber hinaus war das Enzymrecycling im analytischen Maßstab für FjKDO und CpKDO für 4 Reaktionszyklen mit Umsätzen von 100 % bzw. 84 % möglich, wodurch die Raumzeitausbeuten effektiv erhöht wurden. Dabei konnte die immobilisierte CaKDO-HaloTag® und FjKDO-HaloTag® im präparativen Labormaßstab (15 mL) mit 100 mM L-lysine mit 16 g L-1 Produkttiter und Raumzeitausbeuten von 73,4 gProdukt L-1 h-1 pro gimmobilisierter CaKDO bzw. 133,65 gProdukt L-1 h-1 pro gimmobilisierter FjKDO eingesetzt werden. Unter Verwendung einer HaloTag®-immobilisierten Lysindecarboxylase aus Selenomonas ruminantium (SrLDC) wurde das (3S)-Hydroxy-L-Lysin aus der CaKDO-katalysierten Reaktion erfolgreich in (2S)-Hydroxy-Cadaverin decarboxyliert, ohne, dass das Zwischenprodukt aufgereinigt werden musste, wobei ein Produkttiter von 11,6 g L-1 in einer 15-mL-Batch-Reaktion erreicht wurde. Eine erfolgreiche Produkt Aufreinigung war möglich, da die Anwendung isolierter Enzyme, im Gegensatz zu ganzen Zellen oder Rohzellextrakten, sehr saubere Produktüberstände ermöglicht.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Sonstige Einrichtungen/Externe » Institute in Zusammenarbeit mit der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf » Institut für Biotechnologie, Forschungszentrum Jülich GmbH
Dokument erstellt am:	10.01.2023
Dateien geändert am:	10.01.2023
Promotionsantrag am:	05.07.2022
Datum der Promotion:	17.10.2022