Dokument: Functional analysis of TBC1D1 and TBC1D4 in skeletal muscle

Titel:	Functional analysis of TBC1D1 and TBC1D4 in skeletal muscle
Weiterer Titel:	Funktionelle Analyse von TBC1D1 und TBC1D4 im Skelettmuskel
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=61386
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20221208-105234-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	De Wendt, Christian [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,48 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 03.12.2022 / geändert 03.12.2022
Beitragende:	Prof. Dr. Al-Hasani, Hadi [Gutachter] Prof. Dr. Eckhard Lammert [Gutachter]
Stichwörter:	TBC1D1, TBC1D4, skeletal muscle, Diabetes
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Fragestellung Die zwei nah verwandten RabGTPase-aktivierenden Proteine (RabGAPs) TBC1D1 und TBC1D4 (AS160) spielen eine wichtige Rolle für den Glukose- und Fettstoffwechsel im Skelettmuskel. TBC1D4 repräsentiert zudem einen wichtigen Faktor für die Insulinsensitivität des Fettgewebes. In Mäusen verursacht der Verlust jedes dieser RabGAPs in vivo schwere Störungen der Insulinsensitivität in Skelettmuskel und Fettgewebe und einen Wechsel der Energiesubstratpräferenz von Kohlenhydraten zu Fetten. Dieser Wechsel wird von einer gewebespezifischen Reduktion des Glukosetransporters GLUT4 begleitet. Beide Proteine, TBC1D1 und TBC1D4, werden durch die Kinasen AKT und AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK) reguliert, welche bekanntermaßen jeweils in den Insulin- und kontraktionsvermittelten Glukosestoffwechsel involviert sind. Das Ziel dieser Arbeit ist, ein umfassenderes Verständnis der physiologischen Relevanz der zwei RabGAPs zu erlangen. Zu diesem Zweck wurden Tbc1d1- (D1KO), Tbc1d4- (D4KO) und doppelt-defiziente Tbc1d1/4 (D1/4KO) Mäuse untersucht, um drei verschiedene Schwerpunkte zu adressieren: 1) Die metabolische Charakterisierung unter Fütterung einer Hochfettdiät (HFD), 2) Der Beitrag der einzelnen RabGAPs und deren Kinase AMPK zum Bewegungs- und kontraktionsvermittelten Glukosestoffwechsel und 3) Der Mechanismus hinter der Reduktion von GLUT4 im Skelettmuskel RabGAP-defizienter Mäuse. Methoden D1KO-Mäuse wurden mit D4KO und muskel-spezifischen AMPKα2-kinase-dead (TG) Mäusen gekreuzt, um Tiere mit einem Defizit an allen drei Proteinen (TG-D1/4KO) auf einem genetischen C57BL/6J-Hintergrund zu erhalten. Die Toleranz gegenüber Glukose, Insulin und AICAR wurde durch entsprechende Toleranztests an männlichen Mäusen bestimmt. Die Laufleistung wurde in vivo mit einem kalorimetrischen Laufbandsystem gemessen. Die Kontraktions- und Insulin-induzierte 3H-2-Deoxyglucose-Aufnahme wurden ex vivo unter Verwendung isolierter Extensor digitorum longus (EDL)- und Soleus-Muskeln bestimmt. Skelettmuskel- und Lebergewebe wurden auf Protein- und mRNA-Ebene analysiert. Durch in-vivo-Elektroporation (IVE) wurde der Einfluss von TBC1D1 auf die Menge an GLUT4 untersucht, indem verschiedene Tbc1d1-Mutanten und Rab-Proteine im TA-Muskel von D1KO- und C57BL/6J-Mäusen exprimiert wurden, in dem anschließend GLUT4 quantifiziert wurde. Ergebnisse Auf Hochfettdiät zeigten D4KO- und D1/4KO-Mäuse eine verminderte Glukosetoleranz und D1/4KO-Tiere eine gestörte Insulin-Toleranz. Gleichzeitig war ihre Sensitivität für AICAR, eine Substanz, welche Bewegung pharmakologisch imitiert, tendenziell verbessert im Vergleich zu wildtypischen (WT-)Tieren. Die Inaktivierung von AMPK, führte zu einer verminderten körperlichen Leistungsfähigkeit, welche sich durch eine verringerte Laufleistung auf dem Laufband und eine verminderte kontraktionsinduzierte Glukoseaufnahme in EDL und Soleus-Muskel im Vergleich zu wildtypischen Tieren bemerkbar machte. Der zusätzliche Verlust von Tbc1d1, nicht aber Tbc1d4, verstärkte die Effekte auf die Leistungsfähigkeit. Zusätzlicher Verlust von Tbc1d4 (TG-D4KO und TG-D1/4KO), verminderte dagegen die Fähigkeit, Glukose aus dem Blut zu entfernen, was in erhöhten Plasmaglukosespiegeln nach dem fasting-refeeding Experiment resultierte. Zuvor konnten wir und andere Arbeitsgruppen zeigen, dass die GLUT4-Proteinspiegel in glykolytischen Muskeln von Tbc1d1-defizienten (D1KO) Mäusen wesentlich reduziert waren. Die Expression von wildtypischem TBC1D1 und einer Variante mit mutierter PTB-Domäne (R125W), nicht jedoch mit mutierter GAP-Domäne (R941K), stellte die GLUT4-Spiegel im Tibialis anterior (TA)-Muskel von D1KO-Mäusen wieder her. Die Expression des konstitutiv aktiven TBC1D1-Zielproteins Rab14 erhöhte die GLUT4-Expression im TA-Muskel von C57BL/6J-Mäusen. Schlussfolgerungen Diese Arbeit liefert neue Hinweise darauf, dass 1) Der Verlust von beiden RabGAPs zu einer verminderten Insulinsensitivität in Mäusen auf HFD führt, welche vermutlich durch das Fehlen von Tbc1d4, nicht jedoch von Tbc1d1 verursacht wird. In Übereinstimmung damit, entwickeln D1/4KO Mäuse eine höhere Körperfettmasse verglichen mit ihren WT-Wurfgeschwistern. Gleichzeitig wird durch das Fehlen von Tbc1d4 die AICAR-Sensitivität verbessert. 2) Der Verlust von AMPK im Muskel vermindert die Laufleistung auf dem Laufband und den kontraktionsinduzierten Glukosetransport. Zusätzlicher Verlust von Tbc1d1, nicht aber Tbc1d4, verursacht eine weitere Verschlechterung der gesamtkörperlichen Leistungsfähigkeit und des kontraktionsvermittelten Glukosetransports in den glykolytischen EDL-Muskel. Bemerkenswerterweise zeigten Skelettmuskeln, denen AMPK und beide RabGAPs fehlten, immer noch eine restliche kontraktionsinduzierte Glukoseaufnahme. Daher zeigt diese Arbeit die Notwendigkeit eines neuen Signalweges auf, der unabhängig von AMPK, TBC1D1 und TBC1D4 funktioniert. 3) Das Fehlen der GTPase aktivierenden (GAP-)Domäne von TBC1D1 verursacht das GLUT4-Defizit in glykolytischen Muskeln von D1KO-Mäusen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Häufigkeit des Glukosetransporters durch Rab-Proteine reguliert werden muss, welche als Zielproteine von TBC1D1 fungieren. Diese Arbeit konnte RAB8A, RAB14 und RAB12 als mögliche Kandidaten ausschließen. Daher ist weitere Forschung erforderlich, um den vollständigen Mechanismus aufzudecken, der für das GLUT4-Defizit in RabGAP-defizienten Muskeln verantwortlich ist. Background and aims The two closely related RabGTPase-activating proteins (RabGAPs) TBC1D1 and TBC1D4 (AS160) play essential roles in glucose and lipid metabolism in skeletal muscle. TBC1D4, in addition, represents a major factor in adipose tissue insulin sensitivity. In mice, lack of each RabGAP causes severe disturbances in insulin sensitivity of skeletal muscle and adipose tissue and a metabolic switch in energy substrate preference from carbohydrates to lipids in vivo. This switch is accompanied by a tissue-specific reduction in glucose transporter 4 (GLUT4) abundance. Both TBC1D1 and TBC1D4 are directly regulated by their upstream kinases AKT- and AMP-dependent protein kinase (AMPK) which are known to be involved in insulin- and exercise-regulated glucose metabolism, respectively. The aim of this study is to achieve a better understanding of the physiological relevance of the two RabGAPs. For this purpose, Tbc1d1- (D1KO), Tbc1d4- (D4KO) and double-deficient Tbc1d1/4 (D1/4KO) mice are studied to address three different topics: 1) Metabolic characterization under high-fat diet (HFD) conditions, 2) The contribution of each RabGAP and their upstream kinase AMPK to exercise- and contraction-mediated glucose metabolism, respectively, and 3) The mechanism of GLUT4 reduction in skeletal muscle of RabGAP deficient mice. Methods D1KO mice were crossbred with D4KO and muscle-specific AMPKα2 kinase-dead (TG) mice to yield triple-deficient mice (TG-D1/4KO) on a genetic C57BL/6J background. Whole-body tolerance towards glucose, insulin and AICAR were assessed by respective tolerance tests in male mice. In vivo running performance was measured with a caloric treadmill system. Ex vivo contraction- and insulin-stimulated 3H-2-deoxyglucose uptake were determined using isolated Extensor digitorum longus (EDL) and Soleus muscles. Skeletal muscle and liver tissue were analyzed on protein and mRNA levels. In vivo electroporation (IVE) method was used to assess the impact of TBC1D1 on GLUT4 abundance by expressing different Tbc1d1 mutants and Rab proteins in Tibialis anterior (TA) muscle of D1KO and C57BL/6J mice which was subsequently analyzed for GLUT4 abundance. Results Upon HFD intervention, D4KO and D1/4KO mice demonstrated an impaired glucose and D1/4KO a disturbed insulin tolerance. On the other hand, their sensitivity for AICAR, an exercise-mimetic substance, tended to be improved compared to wildtype (WT) animals. Inactivation of AMPK resulted in decreased exercise capacity, indicated by a lower treadmill running performance and impaired contraction-induced glucose uptake in EDL and Soleus muscle compared to wildtype animals. Additional deletion of Tbc1d1 but not Tbc1d4 intensified the effects on running performance and contraction-induced glucose uptake. Additional deficiency of Tbc1d4 (TG-D4KO and TG-D1/4KO) in contrast decreased the ability to clear glucose from the blood resulting in higher plasma glucose levels after fasting-refeeding. Previously, we and others showed that GLUT4 abundance in glycolytic muscle of Tbc1d1-deficient (D1KO) mice was substantially reduced. Expression of wildtype TBC1D1 and its PTB-domain mutant R125W but not the GAP-domain mutant R941K restored GLUT4 levels in tibialis anterior (TA) muscle of D1KO mice. Expression of constitutively active TBC1D1 downstream target Rab14 increased GLUT4 expression in TA muscle of C57BL/6J mice. Conclusion This work provides new evidence that 1) Deletion of both RabGAPs leads to reduced insulin sensitivity in mice upon HFD treatment, probably caused by their Tbc1d4- but not their Tbc1d1-deficiency. According to that, D1/4KO mice develop more body fat mass compared to their WT littermates. However, at the same time loss of Tbc1d4 improves AICAR sensitivity. 2) AMPK deficiency in muscle reduced exercise performance on the treadmill and contraction-induced glucose transport. Additional deletion of Tbc1d1 but not Tbc1d4 caused a further decrease in whole body exercise capacity and contraction-stimulated glucose transport into glycolytic EDL muscle. Remarkably, skeletal muscle lacking functional AMPK and both RabGAPs still exhibited residual contraction-induced glucose uptake. Therefore, this work demonstrates the need for a new signaling pathway independent of AMPK, TBC1D1 and TBC1D4. 3) The absence of the GTPase activating (GAP-)domain of TBC1D1 accounted for the GLUT4 deficit in glycolytic muscles of D1KO mice. In conclusion, the abundance of the glucose transporter must be regulated by Rab proteins that are targeted by TBC1D1. This thesis could exclude RAB8A, RAB14 and RAB12 as possible candidates. Thus, further research is necessary to uncover the full mechanism accounting for GLUT4-deficit in RabGAP-deficient muscles.
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Fachbereich / Einrichtung:	Sonstige Einrichtungen/Externe » An-Institute » Deutsches Diabetes-Zentrum
Dokument erstellt am:	08.12.2022
Dateien geändert am:	08.12.2022
Promotionsantrag am:	15.06.2022
Datum der Promotion:	01.12.2022