Dokument: Interaktion von Titin mit E3-Ubiquitin-Ligasen und Titin-Umbau in Langzeitkultivierung adulter Rattenkardiomyozyten
| Titel: | Interaktion von Titin mit E3-Ubiquitin-Ligasen und Titin-Umbau in Langzeitkultivierung adulter Rattenkardiomyozyten | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=61269 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20221125-104710-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Müller, Erik [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Krüger, Martina [Gutachter] Prof. Dr.med. Joachim Schmitt [Gutachter] Prof.Dr. Anke Fender [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Titin ist mit bis zu 3,7 MDa das größte bekannte Protein. Als drittes Filament durchzieht es ein gesamtes Halbsarkomer von der Z-Scheibe bis zur M-Linie. Titin ist wesentlich für die passiven mechanischen Eigenschaften der (Herz-)Muskulatur verantwortlich und an der Pathogenese zahlreicher Erkrankungen beteiligt. Der Abbau von Titin und auch die Integration in Sarkomere stellen für Muskelzellen herausfordernde Prozesse dar, die bislang wenig erforscht sind. Wesentliche Proteinqualitätskontrollmechanismen sind das Ubiquitin- Proteasom-System (UPS), die Autophagie und weitere Proteasen wie Calpaine. Ziel dieser Arbeit war das Identifizieren von E3-Ubiquitin-Ligasen, die mit Titin interagieren und das Protein somit für einen möglichen Abbau durch o.g. Mechanismen markieren. Hierzu wurden einzelne Titinfragmente (N2A, N2B, PEVK, A168-170, TK) und E3-Ubiquitin- Ligasen (MuRF-1, -2, -3, CHIP, Fbx32, Mdm2) rekombinant synthetisiert, gereinigt und mittels GST-Pulldown-Assay auf Interaktionen geprüft. Ergänzend wurden durch Immunfluoreszenzfärbungen die Lokalisationen der einzelnen Proteine in adulten Rattenkardiomyozyten (ARC) untersucht. Darüber hinaus sollte der Vorgang des Abbaus und des Einbaus von Titin aus bzw. in Sarkomere genauer beleuchtet werden. Hierzu wurden mittels Immunfluoreszenzfärbungen zu verschiedenen Zeitpunkten einer 20-tägigen Zellkultur adulter Rattenkardiomyozyten unterschiedliche Abschnitte des Proteins (Z1Z2, PEVK, M8-M10) während ihres Auf- und Abbaus beobachtet. Im Titin I-Band-Bereich (N2A, N2B, PEVK) zeigten sich Interaktionen mit MuRF-1, -2, -3, CHIP, Fbx32 und Mdm2 übereinstimmend mit einer Lokalisation der Proteine im I-Band von ARC (abgesehen von MuRF-1). Außer CHIP interagierten alle E3-Ligasen auch mit dem A-Band-Bereich von Titin (A168-170, TK), für MuRF-1 und Fbx32 wurde außerdem eine Lokalisation in diesem Bereich nachgewiesen. Zusammengefasst wurden in der vorliegenden Arbeit mehrere neue Interaktionen von Titin mit E3-Ligasen identifiziert, die den Abbau von Titin über die verschiedenen Mechanismen der Proteinqualitätskontrolle (UPS, Autophagie) ermöglichen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass ARC in Langzeitzellkultur eine Art De- und Redifferenzierung durchlaufen und Sarkomerstrukturen, auch Titin, in diesem Prozess ab- und wieder aufgebaut werden. Die Ergebnisse dieser Studie lassen vermuten, dass Titin als intaktes Molekül in das Sarkomer eingebaut wird, wohingegen beim Abbau zunächst der leichter zugängliche I-Band-Bereich und anschließend der schwieriger zugängliche A-Band- Bereich des Proteins abgebaut wird.Titin is the largest known protein with up to 3.7 MDa. As a third filament, it spans an entire half-sarcomere from the Z-disc to the M-band. Titin is essentially responsible for the passive mechanical properties of (cardiac) muscle and is involved in the pathogenesis of numerous diseases. The degradation of titin and also its integration into sarcomeres represent challenging processes for muscle cells that have been poorly understood. Major protein quality control (PQC) mechanisms include the ubiquitin-proteasome system (UPS), autophagy and other proteases such as calpains. The aims of this work were to identify E3 ubiquitin ligases that interact with titin and thus to mark the protein for possible degradation by PQC. For this purpose, single titin fragments (N2A, N2B, PEVK, A168-170, TK) and E3 ubiquitin ligases (MuRF-1, -2, -3, CHIP, Fbx32, Mdm2) were recombinantly synthesized, purified and tested for interactions by GST pulldown assay. Supplemental immunofluorescence staining was used to verify the localizations of each protein in adult rat cardiomyocytes (ARC). In addition, the process of degradation and incorporation of titin from/into sarcomeres should be elucidated in more detail. For this purpose, immunofluorescence staining was used to observe different sections of the protein (Z1Z2, PEVK, M8-M10) during their assembly and disassembly at different time points of a 20 days cell culture of adult rat cardiomyocytes. In the titin I-band region (N2A, N2B, PEVK), interactions with MuRF-1, -2, -3, CHIP, Fbx32, and Mdm2 were consistent with localization of the proteins in the I-band of ARC (except for MuRF-1). Except for CHIP, all ligases also interacted with the A-band region of titin (A168-170, TK) and MuRF-1 and Fbx32 were also shown to localize in this region. In summary, numerous interactions have been identified that may enable titin degradation via multiple mechanisms of protein quality control (UPS, autophagy). Furthermore, it was shown that ARC undergo a kind of de- and redifferentiation in long-term cell culture and sarcomere structures, including titin, are degraded and rebuilt in this process. The results of this study suggest that titin is incorporated into the sarcomere as an intact molecule, whereas during degradation, the more accessible I-band region is degraded first, followed by the more difficult to access A-band region of the protein. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Herz- und Kreislaufphysiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 25.11.2022 | |||||||
| Dateien geändert am: | 25.11.2022 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 10.07.2022 | |||||||
| Datum der Promotion: | 17.11.2022 |
