Dokument: Discrimination between nuclear and cytosolic effects of the small Rho GTPase RAC1 in the DNA damage response

Titel:	Discrimination between nuclear and cytosolic effects of the small Rho GTPase RAC1 in the DNA damage response
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=61144
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20221114-094828-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kitzinger, Rebekka Katharina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 15,30 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 08.11.2022 / geändert 08.11.2022
Beitragende:	Prof. Dr. Fritz, Gerhard [Gutachter] Prof. Dr. Wesselborg, Sebastian [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	RAC1 ist ein molekularer Schalter, der zwischen einem Guanosin-5´-Diphosphat (GDP)-gebundenen (inaktiven) Zustand und einem Guanosin-5´-Triphosphat (GTP)-gebundenen (aktiven) Zustand wechselt, um so die Interaktion mit Effektorproteinen zu ermöglichen. Als molekularer Schalter leitet RAC1 externe Stimuli von der Zellmembran zu Transkriptionsfaktoren, Proteinkinasen und Modulatoren des Cytoskeletts. Es wurden Kernfunktionen von RAC1 identifiziert, die mit Apoptose, Proliferation, Migration und Fortschreiten des Zellzyklus zusammenhängen. Darüber hinaus zeigten Studien eine Beteiligung von RAC1 bei der Reaktion auf genotoxischen Stress. Frühere Untersuchungen ergaben eine Rolle von RAC1 bei der Doxorubicin (Dox)-induzierten DNA-Schadensantwort (DDR). Bis heute ist unklar, ob der beschriebene Schutz gegen DNA Schäden und Zelltod, verursacht durch Topoisomerase II-Gifte, durch pharmakologische Hemmung von RAC1 von cytosolischen und/oder nukleärem RAC1 abhängen. Um die Rolle von RAC1 in der DDR aufzuklären, wurde RAC1 mit EHT 1864 pharmakologisch inhibiert oder durch Transfektion mit siRNA gegen mRac1 herunterreguliert. Anschließend wurde das Dox-induzierte Doppelstrangbruch signaling durch Auswertung fluoreszierender nukleärer γH2AX und 53BP1 Foci sowie der Dox-induzierten DDR durch aktivierte, in die DDR involvierte Proteine mittels Western Blot analysiert. Die Behandlung mit EHT 1864 sowie der knockdown von mRac1 reduzierten die Dox-induzierte DSB-Bildung in ähnlichem Maße. Um die Rolle von nukleärem und cytosolischem RAC1 in der DDR zu klären, wurden in der vorliegenden Arbeit verschiedene humane RAC1 Mutanten (wildtypisch, konstitutiv aktiv, dominant-negativ) transient in embryonalen Fibroblasten der Maus (MEF) exprimiert und anschließend mit Dox behandelt. Zur Unterscheidung zwischen Effekten auf die Dox-induzierte DDR, die durch nukleäres RAC1 und cytosolisches RAC1 hervorgerufen werden, wurden die GFP-hRAC1 Expressionsvektoren mit und ohne zusätzliche Kernlokalisierungssequenz (nuclear localisation sequence, NLS) verwendet. Um Beweise für die Funktionalität der zuvor genannten Expressionsvektoren in MEF zu erhalten, wurde die Bildung von Lamellipodien untersucht. Zur Überprüfung der Funktionalität des zusätzlichen NLS wurde die Lokalisierung von GFP-hRAC1 mit und ohne zusätzliches NLS durch die Messung der Fluoreszenzintensität von GFP-gekoppeltem hRAC1 im Cytoplasma und im Zellkern von zuvor erfolgreich transfizierten Zellen quantifiziert. Die gezielte nukleäre Akkumulation von dominant-negativem hRAC1 sowie von konstitutiv aktivem hRAC1 zeigten ähnliche Effekte, nämlich weniger Dox-induzierte γH2AX und 53BP1 Foci. Die hRAC1 Mutanten veränderten die Dox-induzierte DDR in Konstrukt-abhängiger Weise, wie aus der Menge an detektiertem pP53 und pKAP1 hervorgeht. Da Zellen, die hRAC1 Mutanten exprimierten, keinen Einfluss auf die Dox-induzierte Bildung von pATM Ser1981 Foci zeigten, scheint RAC1 in der DDR downstream oder unabhängig von ATM zu wirken. Die präsentierten Daten führen zu der Annahme, dass RAC1 für eine Aktivierung der Dox-induzierten DDR downstream oder unabhängig von ATM erforderlich ist und eine ausgewogene Menge an aktivem und inaktivem RAC1 im Zellkern eine Voraussetzung für diese Reaktion ist. Darüber hinaus wurde versucht, eine mRac1 knockout Zelllinie zu generieren. Die virale Transduktion wurde zur Induktion des mRac1 knockout verwendet. Die Erzeugung des mRac1 knockout mit einem Cre-Lox-basierten System war prinzipiell möglich, verlief jedoch zytotoxisch, was auch durch die Verwendung eines Pan-Caspase-Inhibitors nicht verhindert werden konnte. RAC1 is a molecular switch that cycles between a guanosine-5'-diphosphate (GDP)-bound (inactive) state and a guanosine 5'-triphosphate (GTP)-bound (active) state which allows interaction with effector proteins. As molecular switch, RAC1 conducts external stimuli from the cell membrane to transcription factors, protein kinases, and modulators of the actin cytoskeleton. Nuclear functions of RAC1 were identified that are related to apoptosis, proliferation, migration and cell cycle progression. Beyond that, studies demonstrated an involvement of RAC1 in response to genotoxic stress. Previous investigations discovered a role of RAC1 in the doxorubicin (Dox)-induced DNA damage response (DDR). Until today, it is unclear whether the described protection against topoisomerase II poison-induced DNA damage and cell death by pharmacological inhibition of RAC1 is dependent on cytosolic RAC1 and/or nuclear RAC1. To elucidate the role of RAC1 in the DDR RAC1 was pharmacologically inhibited with EHT 1864 or silenced by transfection with siRNA against mRac1. Afterwards the Dox-induced double strand break signaling was analyzed by evaluation of fluorescent nuclear γH2AX and 53BP1 foci as well as the Dox-induced DDR by western blot analysis of activated DDR-related proteins. Treatment with EHT 1864 as well as mRac1 knockdown reduced the Dox-induced DSB-formation to a similar extent. To elucidate the role of nuclear and cytosolic RAC1 in the DDR various human RAC1 mutants (wild-type, constitutively active, dominant-negative) were transiently expressed in mouse embryonic fibroblasts (MEF) prior to Dox treatment in the present work. To distinguish between effects on the Dox-induced DDR promoted by nuclear RAC1 and cytosolic RAC1, the GFP-hRAC1 expression vectors were used with and without an additional nuclear localization sequence (NLS). To obtain evidence about the functionality of the aforementioned expression vectors in MEF lamellipodia formation was evaluated. For verification of the functionality of the additional NLS RAC1 localization of GFP-hRAC1 with and without additional NLS was quantified by measuring the fluorescence intensity of GFP-coupled hRAC1 in the cytoplasm and the nucleus of successfully transfected cells. Targeted nuclear accumulation of dominant-negative hRAC1 as well as constitutively active hRAC1 disclosed similar effects namely less Dox-induced γH2AX and 53BP1 foci. hRAC1 mutants altered the Dox-induced DDR in a construct-dependent manner as seen on the amount of pP53 and pKAP1 protein. Since cells expressing hRAC1 mutants exhibited no influence on the Dox-induced pATM Ser1981 foci formation RAC1 seems to act downstream or independent of ATM in the DDR. The presented data are leading to the assumption that RAC1 is required for a substantial activation of the Dox-induced DDR downstream or independent of ATM and balanced levels of active and inactive RAC1 inside the nucleus are a prerequisite for this response. Moreover, an attempt was made to generate a stable mRac1 knockout cell line. Viral transduction was used for induction of the mRac1 knockout. Creation of the mRac1 knockout with a Cre-Lox-based system was principally possible but was cytolethal which could not be prevented by use of a pan caspase inhibitor.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	14.11.2022
Dateien geändert am:	14.11.2022
Promotionsantrag am:	08.12.2021
Datum der Promotion:	19.10.2022