Dokument: Homology modeling-guided medium-throughput screening of novel hydrolases among Pseudomonas aeruginosa genes of unknown function

Titel:	Homology modeling-guided medium-throughput screening of novel hydrolases among Pseudomonas aeruginosa genes of unknown function
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=61016
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20221031-123626-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Babic, Nikolina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 186,89 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 31.10.2022 / geändert 31.10.2022
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Feldbrügge, Michael [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	A rising threat to human health emerges from antibiotic-resistant bacteria, which are already a significant cause of morbidity and mortality. One of the most problematic nosocomial pathogens, a member of the ESKAPE pathogens, is P. aeruginosa. The notorious status of P. aeruginosa is due to its capacity to produce a plethora of different virulence factors and cause severe infections in immunocompromised patients and the existence of multidrug-resistant clones, which have become prevalent worldwide. Although antibiotic resistance is a natural phenomenon, it is highly accelerated by human activities. The main concern is that the development of novel antibiotics significantly lags behind the emergence of resistant clones. The global urge for faster development of novel antibiotics is reflected in the announcement of the World Health Organization, which published a list of bacteria that are the most critical for introducing novel antibiotics. Since clones resistant to the new β-lactam imipenem have been identified, P. aeruginosa is listed in the most critical group. The way to confront this issue is to identify novel therapeutic strategies, drug targets, and their inhibitors (drugs). An obstacle on that road represents the fact that nearly 40 % of the P. aeruginosa genome consists of genes whose functions are still unknown. This often hampers the interpretation of various global proteomics and transcriptomics studies and generally limits our knowledge about bacterial pathology and physiology. Simultaneously, this pool of genes represents a valuable source for research on novel drug targets, possibly revealing novel structures, mechanisms, or metabolic pathways. Moreover, the functional deciphering of genes of unknown function (GUFs) has general significance, as these genes represent a burden in the databases in the current genomic era. In the present work, medium-throughput in silico and experimental characterization of P. aeruginosa GUFs was performed to identify novel drug targets. The comparative genomic analysis revealed 106 GUFs as a drug-target research priority group based on their sequence similarity to other virulence factors, pathogen-specific genes, essential roles, and the absence of homologues among human genes. Furthermore, putative biochemical functions were assigned to 1267 P. aeruginosa GUFs based on 3D structural homology modelling. This analysis revealed that more than 1000 proteins of unknown function (PUFs) had putative enzyme functions, including 566 putative hydrolases. Since many essential, virulence-related, and antibiotic resistance proteins have hydrolase functions, this set of genes was further experimentally characterized. To that end, the novel broad-host-range pGUF vector was assembled and used to generate an expression plasmid library consisting of 606 pGUF-guf constructs. The medium-throughput expression of 460 GUFs from pGUF-guf constructs, including 429 putative hydrolases, was conducted in E. coli with an expression success rate of 76 %. The screening of hydrolase activities using E. coli cell lysates and 15 different substrates resulted in 57 positives. Finally, in a separate experiment, 18 novel hydrolase activities were confirmed, including five esterases, one thioesterase, two lipases, six phospholipases A, two phospholipases C and three phosphodiesterases and phosphatases. Further analysis of these genes led to the identification of two putative virulence factors and three biofilm effectors, representing novel candidates for drug targets. Eine zunehmende Bedrohung der menschlichen Gesundheit geht von antibiotikaresistenten Bakterien aus, die bereits eine bedeutende Ursache für Morbidität und Mortalität darstellen. Eines der problematischsten nosokomialen Pathogene, ein Mitglied der ESKAPE-Erreger, ist P. aeruginosa. Der berüchtigte Status von P. aeruginosa ist auf seine Fähigkeit zurückzuführen, eine Vielzahl verschiedener Virulenzfaktoren zu produzieren und schwere Infektionen bei immungeschwächten Patienten zu verursachen, sowie auf das Vorhandensein von multiresistenten Klonen, die sich weltweit verbreitet haben. Obwohl die Antibiotikaresistenz ein natürliches Phänomen ist, wird sie durch menschliche Aktivitäten stark beschleunigt. Das Hauptproblem ist, dass die Entwicklung neuer Antibiotika deutlich hinter dem Auftreten resistenter Klone zurückbleibt. Das weltweite Drängen auf eine schnellere Entwicklung neuer Antibiotika spiegelt sich in der Ankündigung der Weltgesundheitsorganisation, in der die Pathogene, die für die Einführung neuer Antibiotika am kritischsten sind, veröffentlicht wurden. Seit der Identifizierung von Klonen, die gegen das neue β-Lactam, Imipenem, resistent sind, wird P. aeruginosa in der kritischsten Gruppe geführt. Der Weg zur Lösung dieses Problems besteht darin, neue therapeutische Strategien, therapeutische Ansatzpunkte und deren Inhibitoren (Medikamente) zu identifizieren. Ein Hindernis auf diesem Weg ist die Tatsache, dass fast 40 % des Genoms von P. aeruginosa aus Genen besteht, deren Funktionen noch unbekannt sind. Dies erschwert häufig die Interpretation verschiedener globaler Proteom- und Transkriptomstudien und schränkt unser Wissen über die Pathologie und Physiologie der Bakterien generell ein. Gleichzeitig stellt diese Gengruppe eine wertvolle Quelle für die Erforschung neuer Arzneimittelziele dar, die möglicherweise neue Strukturen, Mechanismen oder Stoffwechselwege offenbaren. Darüber hinaus ist die funktionelle Entschlüsselung von Genen mit unbekannter Funktion (GUFs) von allgemeiner Bedeutung, da diese Gene im gegenwärtigen Zeitalter der Genomik eine Belastung für die Datenbanken darstellen. In der hier vorgestellten Arbeit wurde eine in silico und experimentelle Charakterisierung von P. aeruginosa-GUFs mit mittlerem Durchsatz durchgeführt, um neue Arzneimittelziele zu identifizieren. Die vergleichende Genomanalyse ergab, dass 106 GUFs aufgrund ihrer Sequenzähnlichkeit mit anderen Virulenzfaktoren, pathogen-spezifischer Genen, essenzieller Funktionen und des Fehlens von Homologen unter menschlichen Genen eine vorrangige Gruppe für die Arzneimittelforschung darstellen. Darüber hinaus wurden 1267 P. aeruginosa-GUFs auf Grundlage der 3D-Strukturhomologiemodellierung mutmaßliche biochemische Funktionen zugewiesen. Diese Analyse ergab, dass mehr als 1000 Proteine mit unbekannten Funktionen (PUFs) mutmaßliche Enzymfunktionen haben, darunter 566 mutmaßliche Hydrolasen. Da viele essenzielle virulenzbezogene und antibiotikaresistente Proteine Hydrolasefunktionen haben, wurde diese Gruppe von Genen weiter experimentell charakterisiert. Zu diesem Zweck wurde der neuartige pGUF-Vektor mit breiter Wirtsreichweite zusammengesetzt und zur Erzeugung einer Expressionsplasmidbibliothek verwendet, die aus 606 pGUF-guf-Konstrukten besteht. Die Expression von 460 GUFs aus pGUF-guf-Konstrukten, darunter 429 mutmaßliche Hydrolasen, wurde im mittleren Durchsatz in E. coli mit einem Expressionserfolg von 76 % durchgeführt. Das Screening der Hydrolaseaktivitäten unter Verwendung von E. coli-Zelllysaten und 15 verschiedenen Substraten ergab 57 positive Klone. In einem separaten Experiment wurden schließlich 18 neue Hydrolaseaktivitäten bestätigt, darunter fünf Esterasen, eine Thioesterase, zwei Lipasen, sechs Phospholipasen A, zwei Phospholipasen C und drei Phosphodiesterasen und Phosphatasen. Die weitere Analyse dieser Gene führte zur Identifizierung von zwei mutmaßlichen Virulenzfaktoren und drei Biofilm-Effektoren, die neue Kandidaten für Arzneimittel sind.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	31.10.2022
Dateien geändert am:	31.10.2022
Promotionsantrag am:	18.11.2021
Datum der Promotion:	25.04.2022