Dokument: In vivo-Modulation von Signalwegen in kardiomyozytenspezifischen AKT-1/2-Doppel-Knockout-Mäusen

Titel:In vivo-Modulation von Signalwegen in kardiomyozytenspezifischen AKT-1/2-Doppel-Knockout-Mäusen
Weiterer Titel:In vivo modulation of signal pathways in cardiomyocyte-specific AKT-1/2 double knockout mice
URL für Lesezeichen:https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=61001
URN (NBN):urn:nbn:de:hbz:061-20221027-105901-9
Kollektion:Dissertationen
Sprache:Deutsch
Dokumententyp:Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:Text
Autor: Breuling, Lukas [Autor]
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Dateien vom 24.10.2022 / geändert 24.10.2022
Beitragende: Prof. Dr. Axel Gödecke [Gutachter]
PD Dr. med. Stegbauer, Johannes [Gutachter]
Stichwörter:AKT, AMPK
Dewey Dezimal-Klassifikation:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:Die Proteinkinase AKT fördert als wichtiger Vermittler anaboler Prozesse Wachstum über mTORC1-Aktivierung sowie Überleben und Proliferation über inhibitorische Phosphorylierung von FOXO-Transkriptionsfaktoren. Ein kardialer AKT-1/2-Doppel-Knockout führt in Mäusen zu letalem Herzversagen. Bisher ist unbekannt, welche AKT-Substrate dabei beteiligt sind. Daher sollte in dieser Arbeit durch Wiederherstellung AKT-vermittelter Teilfunktionen deren Bedeutung für den beobachteten Phänotyp untersucht werden: zum einen über Expression einer konstitutiv aktiven Rheb Q64L-Mutante zur mTORC1-Aktivierung, zum anderen über Expression einer panFOXO shRNA zur Reduktion der FOXO-Proteinmenge. Die Katabolismus-fördernde Proteinkinase AMPK ist bedeutend für die Homöostase des zellulären Energiestatus. Dennoch wurde in kardialen AKT-1/2-Doppel-Knockout-Mäusen trotz progredienter energetischer Verarmung eine vermehrte inhibitorische AMPK-Serin-485/491-Phosphorylierung beobachtet. Ein zweites Ziel dieser Arbeit bestand darin, durch Wiederherstellung der AMPK-Aktivität mittels Expression einer nicht-inaktivierbaren AMPK-α2-S491A-Mutante deren Bedeutung für die beobachteten phänotypischen Veränderungen zu ermitteln.
Zunächst wurde die Expression von Plasmidsequenzen zur Wiederherstellung der Teilfunktionen mittels transienter Zelltransfektion und folgender Western Blot-Analyse überprüft. Die Rheb Q64L-vermittelte mTORC1-Aktivierung konnte gezeigt werden. Ein weiteres Plasmid enthielt eine loxP-flankierte GFP-Expressionskassette zur Cre-abhängigen, induzierbaren Rheb Q64L-Expression. Nach transienter Zelltransfektion und Koexpression einer Cre-Rekombinase wurde sowohl durchflusszytometrisch als auch auf Western Blot-Ebene eine reduzierte GFP-Expression nachgewiesen. Eine vermehrte Rheb Q64L-Expression blieb jedoch aus, sodass dieses Plasmidkonstrukt nicht weiterverwendet wurde. Da die Expression einer panFOXO shRNA trotz vorheriger FACS-basierter Zellsortierung nur zu einer moderaten Reduktion der FOXO3A-Menge führte, wurde auf die weiterführende Untersuchung verzichtet. Für die AMPK-α2-S491A-Variante konnte eine fehlende inhibitorische Phosphorylierung nachgewiesen werden.
Daraufhin wurden Tamoxifen-induzierbare, kardiale AKT-1/2-Doppel-Knockout-Mäuse mit Adeno-assoziierten Viruspartikeln vom Serotyp 9 zur Rheb Q64L- bzw. AMPK-α2-S491A-Expression infiziert. Echokardiographisch im Zeitverlauf ermittelte kardiale Funktionsparameter sowie das Überleben wurden mit nicht-infizierten Knockout-Tieren verglichen. Post mortem wurde die Transgenexpression mittels qPCR bzw. Western Blot-Analyse überprüft. Rheb Q64L-infizierte Tiere zeigten keine Unterschiede im Vergleich zur Kontrollgruppe. Da das Rheb Q64L-Transgen kardial nur gering exprimiert wurde, blieb unklar, ob die induzierte Aktivierung des mTORC1-Signalweges den kardialen Phänotyp nicht beeinflusst oder ob die Expression nicht ausreichend war, um einen Effekt zu erzielen. AMPK-α2-S491A-infizierte Tiere zeigten eine verlangsamte Verschlechterung einiger kardialer Funktionsparameter und ein tendenziell verlängertes Überleben. Eine kardiale Infektion mit jedoch unklarer Effizienz wurde nachgewiesen. Es konnte von einer kardioprotektiven AMPK-Wirkung ausgegangen werden, die die Progredienz der Knockout-induzierten Herzinsuffizienz zumindest partiell abschwächt. Daher scheint die inhibitorische AMPK-Serin-485/491-Phosphorylierung im AKT-1/2-Doppel-Knockout-Modell zur kardialen Funktionseinschränkung beizutragen.

As an important mediator of anabolic processes, protein kinase AKT promotes growth via mTORC1 activation as well as survival and proliferation via inhibitory phosphorylation of FOXO transcription factors. Cardiac AKT-1/2 double knockout mice develop lethal heart failure. So far it is unknown which AKT substrates mediate the observed restriction. Therefore, by restoring AKT mediated subfunctions, their importance for the observed phenotype was examined in this work: on the one hand by expressing a constitutively active Rheb Q64L mutant to activate mTORC1 signaling, on the other hand by expressing a panFOXO shRNA to reduce the amount of FOXO protein. Catabolism-promoting protein kinase AMPK is of central importance for homeostasis of the cellular energy status. Surprisingly, an increased inhibitory AMPK serine 485/491 phosphorylation was detected in cardiac AKT-1/2 double knockout mice despite progressive energetic depletion. A second aim of this work was to determine the importance of AMPK for the observed cardiac changes by restoring the AMPK activity through expression of a non-inactivatable AMPK-α2-S491A mutant.
First, the expression of plasmid sequences to restore the partial functions was investigated by transient cell transfection and subsequent Western Blot analysis. Rheb Q64L mediated activation of mTORC1 signaling was shown. Another plasmid contained a loxP flanked GFP expression cassette for Cre dependent, inducible Rheb Q64L expression. After transient cell transfection and co-expression of a Cre recombinase, reduced GFP expression was detected both by flow cytometry and Western Blot. However, an increased Rheb Q64L expression did not occur. Therefore, this plasmid construct was no longer used. Since the expression of panFOXO shRNA led only to a moderate reduction of FOXO3A amount despite prior FACS-based cell sorting, no further investigation was carried out. For the AMPK-α2-S491A variant a lack of inhibitory phosphorylation was demonstrated.
Tamoxifen-inducible, cardiac AKT-1/2 double knockout mice were then infected with adeno-associated virus particles of serotype 9 for Rheb Q64L or AMPK-α2-S491A expression. Cardiac function parameters determined over time by echocardiography as well as survival were compared with non-infected knockout mice. After the animals’ death, transgene expression was investigated by qPCR or Western Blot analysis. In Rheb Q64L infected mice, no difference was detected in comparison to the control group. Since the Rheb Q64L transgene was only slightly expressed in hearts, it remained unclear whether the induced activation of mTORC1 signaling did not influence the cardiac phenotype or whether the expression was insufficient for achieving an effect. AMPK-α2-S491A infected mice showed a slowed deterioration of some cardiac function parameters and a tendency towards prolonged survival. Cardiac infection was demonstrated. However, infection effectiveness remained unclear. An AMPK-mediated, cardioprotective effect can be assumed, which at least partially blunts the progression of knockout-induced heart failure. Therefore, the inhibitory phosphorylation of AMPK serine 485/491 in the AKT-1/2 double knockout model seems to contribute to the cardiac function restriction.
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Fachbereich / Einrichtung:Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Herz- und Kreislaufphysiologie
Dokument erstellt am:27.10.2022
Dateien geändert am:27.10.2022
Promotionsantrag am:09.03.2022
Datum der Promotion:18.10.2022
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