Dokument: Interaktion zwischen T-Lymphozyten und dem peripheren Nerv – ein neues In-vitro-Modell
| Titel: | Interaktion zwischen T-Lymphozyten und dem peripheren Nerv – ein neues In-vitro-Modell | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=60711 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20220929-105952-4 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Hattenhauer, Sandra Tessa [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Kieseier, Bernd C. [Gutachter] Dr. med. Spaniol, Kristina [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Autoimmune Polyneuropathien des peripheren Nervensystems (PNS) sind durch zelluläre Infiltration, Demyelinisierung und axonale Schädigung des betroffenen Abschnitts des PNS charakterisiert. Der Großteil des heutigen Verständnisses über die Rolle der T-Lymphozyten in der Interaktion mit dem peripheren Nervensystem stammen von einem Tiermodell, der experimentellen autoimmunen Neuritis (EAN). Jedoch ist unklar, wie CD4+ und/oder CD8+-T-Lymphozyten am Prozess der Demyelinisierung beteiligt sind. Um die Interaktion zwischen T-Lymphozyten und Myelinscheide zu untersuchen, entwickelten wir ein Live-imaging-in-vitro-Modell. Myelinisierte Axone von Ratten-Dorsalstrangganglien (DRG) sind hierbei ein etabliertes Modell des peripheren Nervensystems. Hierfür wurden DRG von Embryonen (E16) von Lewis-Ratten präpariert, kultiviert, nach einer Woche die Myelinisierung angeregt und für zwei weitere Wochen fortgeführt. Die T-Lymphozyten wurden nach 10 Tagen aus Lewis-Ratten isoliert, die mit peripherem Myelinprotein P255–78 immunisiert wurden. Als Kontrollgruppe wurden T-Lymphozyten von gesunden Ratten gewonnen. Nach magnetischer Zellseparation von CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten konnte der spezifische Effekt neuritogener T-Lymphozyten getrennt betrachtet werden. Zur Untersuchung vitaler T-Lymphozyten erfolgte die Färbung mittels orange cell tracker. Die Myelinanalyse in der vitalen Kultur erfolgte mittels Green-fatty-acid-Färbung. Die Experimente erfolgten in einer entsprechend klimatisierten Mikroskopkammer, die gefärbten T-Lymphozyten wurden der DRG-Kultur zugegeben und die Interaktion von T-Lymphozyten und Myelin aufgezeichnet. Die Herausforderung war die erfolgreiche Etablierung eines Modells, in dem DRG-Kultur und T-Lymphozyten vital bleiben und durch live imaging ohne Signalverlust stabil überwacht werden können. Die Färbungen des Myelins und der T-Lymphozyten zeigten über den Überwachungszeitraum nur geringe Ausbleichung. Der Versuchsaufbau ermöglicht, die Interaktion zwischen T-Lymphozyten und Myelin in Co-Kultur zu studieren. Dabei zeigte sich nach dem initialen Kontakt die Anzahl der CD4+-T-Lymphozyten mit Myelinkontakt stabil, wohingegen die Anzahl der CD8+-T-Lymphozyten-Myelin-Kontakte über den Überwachungszeitraum zunahm. Ebenso ließ sich die Migration der T-Lymphozyten untersuchen. In der Gruppe neuritogener CD4+-T-Lymphozyten zeigte sich eine erhöhte Direktionalität, wohingegen die neuritogenen CD8+-T-Lymphozyten eine reduzierte Geschwindigkeit aufwiesen. Die durchgeführte Myelinfärbung mit Sudan Black B zeigte eine Myelinschädigung nach 3 Tagen Co-Kultur mit neuritogenen CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten. Diese Ergebnisse weisen auf eine wichtige Rolle sowohl der CD4+- als auch der CD8+-T-Lymphozyten im Pathomechanismus peripherer autoimmuner Polyneuropathien hin. Dieses neue Modell ermöglicht die detaillierte Analyse der Interaktion zwischen T-Lymphozyten, Schwann-Zellen und Myelin. Gewonnene Erkenntnisse können zur weiteren Entwicklung von Therapiestrategien für entzündliche Erkrankungen des peripheren Nervensystems führen.Immune-mediated inflammatory disorders of the peripheral nervous system (PNS) are characterized by cellular infiltration, demyelination and axonal loss in the affected part of the PNS. Most of our current understanding on the role of T cell immunology affecting the peripheral nerve has been gathered from studies in an animal model, experimental autoimmune neuritis (EAN). However, the precise contribution of CD4+ and/or CD8+ T lymphocytes to the destructive process of demyelination still remains elusive. To shed further light on the precise interactions between T cells, myelin sheaths and axons we established a live imaging in vitro model. Myelinated fibres of rat dorsal root ganglia (DRG) served as a model for the peripheral nerve. DRGs of embryonic (E16) Lewis rats were prepared and cultured, myelination was initiated after one week in vitro and proceeded for two additional weeks. T lymphocytes were obtained from diseased animals with EAN. Lewis rats immunized with P255-78 were sacrificed to obtain T cells of the lymph nodes ten days after immunization. Control T cells were prepared from healthy rats. After magnetic separation of the CD4+ and CD8+ T cells, we studied the specific effect of neuritogenic T lymphocytes. For vital tracking T lymphocytes were stained using orange cell tracker. Myelin detection in vital cultures was assessed by incorporation of C16 fatty acids conjugated with a fluorophore into the myelin layer. Experiments were performed in a conditioned microscope chamber, dyed T-cells were added to the DRG-culture and continuously followed-up. We were able to successfully establish a model system in which DRGs and T lymphocytes remain vital and can be followed by live imaging. The dyes for fatty acids and for T cells exhibited minor bleaching over the monitoring period. The experiments allowed to monitor T cell migration in the myelinated cultures. After initial contact the CD4+ T cell number in close proximity with myelin was almost not altered over the time. However, CD8+ T cells numbers in contact with myelin structures increased during the observation period. The neuritogenic CD4+ T cells show a directional migration, whereas the CD8+ T cells migrate slower. Additional analysis of Sudan Black B staining showed myelin loss after three days co-culture with neuritogenic CD4+ and CD8+ T cells. All these results indicate an important role of CD4+ as well as CD8+ T cells for the pathogenesis of peripheral autoimmune neuropathies. This new model system may represent a useful tool to better understand the interactions between T lymphocytes and Schwann cells forming the myelin sheath as well as axons. In addition, it may be useful in the development of new therapies for inflammatory diseases affecting the peripheral nerve. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 29.09.2022 | |||||||
| Dateien geändert am: | 29.09.2022 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 20.07.2022 | |||||||
| Datum der Promotion: | 22.09.2022 |
