Dokument: Applying unconventional secretion for the export of bivalent Sars-CoV2 nanobodies in Ustilago maydis

Titel:	Applying unconventional secretion for the export of bivalent Sars-CoV2 nanobodies in Ustilago maydis
Weiterer Titel:	Anwendung unkonventioneller Sekretion für den Export bivalenter Sars-CoV2 Nanokörper in Ustilago maydis
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=60599
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20220914-105149-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Philipp, Magnus [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,33 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 08.09.2022 / geändert 08.09.2022
Beitragende:	Prof. Dr. Feldbrügge, Michael [Gutachter] Prof. Dr. Frunzke, Julia [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Durch die stetig steigende Nachfrage an biopharmazeutischen Proteinen, wird ein vielseitiges Repertoire an Proteinproduktionsplattformen benötigt, um die Versorgung maßgeschneiderte Produkte sicherzustellen. Biosynthese und Sekretion funktioneller biopharmazeutischer Proteine wurde bereits im mikrobiellen Modellorganismus Ustilago maydis etabliert. Dazu wurde der unkonventionelle Sekretionsmechanismus der Chitinase Cts1 ausgenutzt. Dieser Sekretionsweg ermöglicht den Export unglykosylierter Proteine, indem das Endomembransystem umgangen wird. Dies kann von Vorteil für den Export bakterieller- und biopharmazeutischer Proteine mit dem Ziel der Nutzung im Menschen sein. Eine weitere vorteilhafte Eigenschaft von Cts1 ist der Fakt, dass Cts1 Chitin bindet. Diese Eigenschaft kann für direkte Proteinaufreinigung und Immobilisierung genutzt werden. Allerdings ist die Ausbeute des Systems bis jetzt nicht kompetitiv und die Möglichkeiten der Cts1 Immobilisierung wurden noch nicht ausgeschöpft. In dieser Arbeit wurden zwei Strategien verfolgt, um unkonventionelle Sekretion für die Produktion und zielorientierte Anwendung von Proteinen zu nutzen: i) Um das verfügbare Repertoire exportierbarer Ziele zu erhöhen, wurde ein neues Exportprotein etabliert. Neuste Erkenntnisse haben den potenziellen Ankerfaktor Jps1, nicht nur als notwendigen Bestandteil für die Lokalisierung und Sekretion von Cts1, sondern auch als potentiell sekretiertes Protein, identifiziert. Um diesen Aspekt näher zu beleuchten, wurde β-Glucuronidase mit Jps1 sekretiert, wodurch unkonventionelle Sekretion und 2.7-fach höhere Ausbeute im Vergleich zum Export mit Cts1 nachgewiesen werden konnten. In Kombination mit vorher etablierten induzierbaren Sekretionsstämmen konnte die Ausbeute weiter erhöht werden. Außerdem, konnten aktive Luciferase und ein bivalenter, synthetischer anti-Sars-CoV2 Nanokörper als Jps1 Fusionen sekretiert werden. ii) Mit dem Ziel Sars-CoV2 Detektion mit Nanokörpern und Immobilisierung von Cts1 zu verbinden, wurden weitere mit Cts1 sekretierte anti-Sars-CoV2 Nanokörper Varianten grundlegend auf ihre Produktions- und Sekretionseigenschaften untersucht. Zwei funktionelle Cts1-Fusionsporteine wurden weiter auf ihre Fähigkeit Sars-CoV2 zu Binden und Neutralisieren untersucht, wobei ein Nanokörper beide Kriterien erfüllte. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde ein ELISA-artiger Sars-CoV2 Antigentest auf eine Chitinoberfläche etabliert. Um dieses System weiter zu verbessern, wurden unkonventionell sekretierte Nanokörper Varianten mit der Peroxidase Apex2 fusioniert, um direkte Detektion des Antigens zu ermöglichen. Zusammenfassend konnte die sekretorische Ausbeute erhöht und das Repertoir sekretierbarer Zielproteine durch die Nutzung von Jps1 erweitert werden. Des Weiteren konnte durch Verbindung einer Chitinoberfläche und Nanokörper-Cts1 Fusionen ein neuartiges Virusdetektionssystem etabliert werden. With an ever-rising demand for biopharmaceuticals, a versatile repertoire of protein production platforms to enable supply of tailor-made solutions for products is needed. Biosynthesis and secretion of functional biopharmaceuticals has previously been established in the microbial model Ustilago maydis. This was achieved by hitchhiking the unconventional secretion mechanism of chitinase Cts1. The pathway allows for the export of unglycosylated proteins circumventing the endomembrane system, which can be advantageous for bacterial targets or biopharmaceuticals to be used in humans. A positive side-effect of using Cts1 as a carrier is its ability to bind chitin which can be exploited for target protein purification or surface immobilization. However, yields of the expression system are not competitive and application of the immobilization capability has not been fully exploited, yet. In this study two strategies were followed towards utilizing of unconventional secretion for protein production and target-oriented application: i) To enhance the repertoire of exported targets, a novel protein export carrier was established. Recent insights into the secretory mechanism of Cts1 revealed the putative anchoring factor Jps1 not only as a crucial player for Cts1 localization and secretion but also as a potential secretion target itself. To this end, Jps1 secretion was confirmed using β-glucuronidase as an established reporter, revealing up to 2.7-fold increased secretion compared to Cts1-mediated export. These findings were combined with the previously established inducible secretion system, further enhancing secretory yield. Additionally, export of functional luciferase and bivalent synthetic anti-Sars-CoV2 nanobodies was achieved with Jps1 as a carrier. ii) With the aim to combine Sars-CoV2 detection and chitin immobilization of Cts1, further unconventionally secreted anti-Sars-CoV2 nanobody variants were studied in depth, starting with characterization of their production and export using Cts1 as a carrier. Two functional Cts1-fusions were tested for their capability of Sars-CoV2 capture and neutralization, revealing one construct capable of both. Subsequently an ELISA type Sars-CoV2 antigen test based on a chitin surface was successfully established, allowing for detection of Sars-CoV2 receptor binding domain in the nanomolar range. To further improve the virus detection system U. maydis derived nanobody variants were functionalized for direct detection utilizing peroxidase Apex2. In summary, secretory yield and target variety could be increased utilizing Jps1 and functionalization of a chitin surface and nanobody-Cts1 fusions resulted in the development of a novel type of virus detection system.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Bezug:	07.2018-07.2022
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	14.09.2022
Dateien geändert am:	14.09.2022
Promotionsantrag am:	21.04.2022
Datum der Promotion:	14.07.2022