Dokument: Untersuchung zur Phosphorylierung von Proteinkinase B sowie Phosphorylierung und Expression von Signal Transducer and Activator of Transcription 5 in der Signalübertragung der ischämischen Fernpräkonditionierung des Herzens
| Titel: | Untersuchung zur Phosphorylierung von Proteinkinase B sowie Phosphorylierung und Expression von Signal Transducer and Activator of Transcription 5 in der Signalübertragung der ischämischen Fernpräkonditionierung des Herzens | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=60526 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20221005-104505-1 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Reiter, Christian [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. rer. nat. Bauer, Inge [Gutachter] PD Dr. med. Aubin, Hug [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Ischämische Konditionierung; IPC; RIPC | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Hintergrund: Bei der ischämischen Fern-Präkonditionierung („remote ischemic preconditioning“ = RIPC) handelt es sich um eine effektive Methode, das Herz vor ischämischer Schädigung, wie sie beispielsweise bei Myokardinfarkten oder während herzchirurgischer Eingriffe auftritt, zu schützen. Obwohl experimentelle Studien vielversprechend sind, liefern klinische Studien zum Teil widersprüchliche Ergebnisse. Es ist daher wichtig, die molekularen Grundlagen dieses Phänomens vollständig aufzudecken, um es anschließend in eine Verbesserung der Patientenversorgung überführen zu können. In Studien zu anderen Formen der ischämischen Konditionierung kommt zwei intrazellulären Signalwegen besondere Relevanz zu, dem „reperfusion injury salvage kinases” oder „RISK“ Signalweg und dem „survivor activating factor enhancement” oder „SAFE“ Signalweg.
Ziele: Ziel dieser Studie war es, die Phosphorylierung der Proteinkinase B (Akt), einem zentralen Protein des RISK Signalwegs, sowie die Phosphorylierung und Expression von STAT5, einem Element des SAFE Signalweges, im Rahmen der RIPC zu untersuchen. Methode: Nach Genehmigung durch die Tierschutzbehörde wurden männliche Wistar Ratten zwei Versuchsprotokollen unterzogen. Die Randomisierung fand innerhalb des jeweiligen Protokolls statt. Das erste Versuchsprotokoll umfasste zwei Gruppen (n=6 /Gruppe): Die Herzen wurden 10 Minuten nach Ende der jeweiligen Intervention entnommen (TP1). Tiere der ersten Versuchsgruppe (RIPC TP1) erhielten eine RIPC Behandlung (4x5 Minuten Ischämie gefolgt von 5 Minuten Reperfusion) mittels einer aufblasbaren Manschette am Hinterlauf. Die zweite Versuchsgruppe (Sham TP1) erhielt eine analoge Placebo-Behandlung (Sham). Das zweite Versuchsprotokoll umfasste vier Versuchsgruppen (n=6 /Gruppe). Die Herzen wurden 165 Minuten nach RIPC bzw. Sham entnommen (TP2). Zwei Gruppen erhielten, entsprechend dem ersten Protokoll, eine RIPC-, zwei weitere eine Sham Intervention. Anschließend wurden die Tiere thorakotomiert und, mittels einer um den Ramus Interventricularis Anterior gelegten Fadenschlinge, eine Myokardischämie von 35 Minuten induziert (I/R und RIPC + I/R) oder eine analoge Placebo-Intervention durchgeführt (Sham TP2 und RIPC TP2). Als Maß für die Aktivierung von Akt und STAT5 wurde die relative Expression der phosphorylierten Formen im Herzgewebe bestimmt. Nach Isolation der zytosolischen Proteine und Auftrennung mittels Western Blot-Verfahren wurden die zu untersuchenden Proteine mit Antikörpern markiert, anschließend mittels Chemolumineszenz detektiert und die Signalstärke digital analysiert. Die so ermittelten Signalstärken der phosphorylierten Proteinformen wurden mit den Signalstärken der Gesamtmenge des jeweiligen Proteins in Relation gesetzt, um die relative Expression zu ermitteln. Darüber hinaus wurden die Signalstärken der Gesamtmenge von STAT5 in den Kompartimenten Zytosol und Zellkern ermittelt und verglichen, um eine mögliche Translokation zu erfassen. Zur statistischen Auswertung wurden Mittelwerte und Standardabweichungen ermittelt. Die Signifikanz der Ergebnisse wurde mithilfe des ungepaarten, zweiseitigen t-Tests mit einem Signifikanzniveau von p<0,05 bestimmt. Ergebnis: Für Akt und STAT5 konnte zu keinem untersuchten Zeitpunkt eine gesteigerte Phosphorylierung durch RIPC gezeigt werden (stets Sham vs. Versuchsgruppe) (Akt: TP1: 0,71 ±0,57 vs. 0,93 ±0,73; P=0,57; TP2: 0,13 ±0,05 vs. 0,15 ±0,12; P=0,77/ STAT5: 0.27 ±0.08 vs. 0,25 ±0,07; P=0,70; TP2: 0,036 ±0,014 vs. 0.03 ±0.01; P=0.17) . Auch nachfolgende Ischämie und Reperfusion konnte keine Phosphorylierung von Akt oder STAT5 durch RIPC induzieren (Akt: 1,36 ±1,07 vs.2 ±1,30; P=0,300/ STAT5: 0,26 ±0,12 vs. 0,34 ±0,10; P=0,22) . Es konnte keine Abnahme der relativen Expression von STAT5 im Zytosol zehn Minuten nach RIPC beobachtet werden (0,79 ±0,33 vs.1,29 ±0,54; P=0,09). Der Nachweis einer Translokation von STAT5 in den Zellkern gelang nicht (1,0 ±0,34 vs.0,72 ±0,28; P=0,15). Schlussfolgerung: RIPC geht zu den untersuchten Zeitpunkten nicht mit einer Aktivierung von Akt oder STAT5 einher. Eine Translokation von STAT5 findet zum untersuchten Zeitpunkt ebenfalls nicht statt. Dass es zu anderen als den hier untersuchten Zeitpunkten zu einer Aktivierung von Akt oder STAT5 oder zu einer Translokation von STAT5 kommt, ist möglich und sollte Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.Background: Remote ischemic preconditioning (RIPC) is a powerful method to protect the heart from ischemic damage as it may, for example, occur during myocardial infarction or cardiac surgery. Yet, to this day, the molecular mechanisms that underlie the phenomenon are not fully understood. While the effect is easily reproducible under experimental conditions, clinical studies have produced conflicting results. To convert this powerful effect into an actual improvement in patient care, it will therefore be crucial to fully uncover the molecular mechanisms on the cellular level. Many possible messenger proteins and pathways have been investigated. In studies on other forms of ischemic conditioning, two pathways seem to stand out: The “reperfusion injury salvage kinases” pathway (RISK) and the “survivor activating factor enhancement” pathway (SAFE). Objective: The aim of this study was to investigate the role of Protein-Kinase B (Akt), a central protein of the RISK pathway as well as the role of STAT5, a possible element of the SAFE pathway during RIPC. Method: With ethical approval from the State Agency for Nature, Environment and Consumer Protection, male Wistar rats were assigned to two different experimental protocols: In the first experimental protocol, male Wistar rats were randomized into 2 groups (n=6 per group). Hearts were excised 10 minutes after completion of the intervention (TP1): The first group received a RIPC treatment through a hind limb inflatable pressure cuff (RIPC TP1), while the second group received a placebo treatment (Sham TP1). In the second experimental protocol, the rats were randomized into 4 groups (n=6 per group) that either underwent RIPC or sham treatment prior to 35 min of ischemia by occlusion of the left anterior descending coronary artery through thoracotomy either followed by 120 min reperfusion (I/R and RIPC + I/R) or a respective placebo treatment (Sham TP2 or RIPC TP2). To determine activation of Akt and STAT5, relative expression of the phosphorylated forms was measured. To detect a possible translocation of STAT5 from the cytosol into the nucleus, relative expression was measured in the two cellular compartments and compared. After isolation of the cytosolic proteins, western-blot analysis was performed. The target proteins and their phosphorylated forms were marked with specific antibodies. Chemiluminescence was used to measure antibody load through digital camera imaging. The signal strength of the phosphorylated proteins was then compared to the signal strength of the total amount of the protein to calculate relative expression. Mean values and standard deviations were calculated. Statistical significance was determined using the unpaired, two-sided t-test with a level of significance of p <0,05. Results: The results show that the relative phosphorylation for Akt as well as STAT5 was not altered by RIPC at the timepoints measured: (Sham vs. Experimental group) (Akt: TP1: 0,71±0,57 vs. 0,93±0,73; P=0,57; TP2: 0,13±0,05 vs. 0,15±0,12; P=0,77/ STAT5: 0.27±0.08 vs. 0,25±0,07; P=0,70; TP2: 0,036±0,014 vs. 0.03±0.01; P=0.17). Subsequent ischemia and reperfusion were not able to induce phosphorylation of Akt or STAT5 through RIPC: (Akt: 1,36±1,07 vs.2±1,30; P=0,300/ STAT5: 0,26±0,12 vs. 0,34±0,10; P=0,22). No decrease in cytosolic STAT5 relative expression levels could be observed at TP1: (0,79±0,33 vs.1,29±0,54; P=0,09). Relative expression of STAT5 in the nucleus was not altered at TP1: (1,0±0,34 vs.0,72±0,28; P=0,15). Conclusion: RIPC may not involve activation of Akt or STAT5, at least not at the specific time points examined in this study. STAT5 does not seem to translocate into the nucleus after RIPC. Involvement of Akt or STAT5 at other time points remains a possibility and should be the subject of future studies. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 05.10.2022 | |||||||
| Dateien geändert am: | 05.10.2022 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 28.01.2022 | |||||||
| Datum der Promotion: | 28.07.2022 |
