Dokument: Design, Synthese und Charakterisierung neuartiger photocaged compounds – Optimierte Werkzeuge zur Etablierung wellenlängenselektiver Genexpression
| Titel: | Design, Synthese und Charakterisierung neuartiger photocaged compounds – Optimierte Werkzeuge zur Etablierung wellenlängenselektiver Genexpression | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=60411 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20220823-111745-5 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Hogenkamp, Fabian [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Pietruszka, Jörg [Gutachter] Prof. Dr. Czekelius, Constantin [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | Photocaged compounds sind optochemische Werkzeuge, welche die lichtgesteuerte Freisetzung von biologischen Effektormolekülen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglichen. Licht gewährleistet dabei als orthogonaler, externer und einfach regulierbarer Stimulus eine nicht-invasive Steuerung von biologischen Prozessen, wie der Genexpression. Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Entwicklung und in vitro Charakterisierung von neuartigen photolabil-geschützten Induktoren, welche eine simultane, wellenlängenselektive Kontrolle über mehrere, biotechnologisch relevante Promotoren ermöglichen sollen.
Der Fokus lag zunächst auf der Synthese von photocaged compounds, welche verbesserte Eigenschaften für die Anwendung in mikrobiellen Organismen aufweisen sollten. Induktoren aus den Molekülklassen der Kohlenhydrate sowie der aliphatischen und der aromatischen Carbonsäuren (Propionsäure bzw. Benzoesäure-Derivate) konnten mit einer photolabilen Schutzgruppe versehen und in einem iterativen Prozess optimiert werden. Bei den photoabspaltbaren Schutzgruppen handelte es sich entweder um Vertreter der o Nitrobenzyl-, (Cumarin-4-yl)methyl- oder Trimethyllock-Chromophore. Die mit o Nitrobenzyl-Derivaten versehenen Induktoren wurden im Hinblick auf eine Belichtung bei 375 nm konzipiert, wohingegen die (Cumarin-4-yl)methyl- und Trimethyllock-geschützten Effektormoleküle für eine Anregung oberhalb von 400 nm entworfen wurden. So konnten erfolgreich eine diverse Bibliothek, bestehend aus 30 photolabil-geschützten Effektormolekülen, dargestellt und ihre relevanten Parameter für eine in vivo Anwendung wie Quantenausbeute sowie Löslichkeit und Stabilität in wässrigen Medien bestimmt werden. Durch eine Kooperation mit M. Sc. Fabienne Hilgers (Institut für Molekulare Enzymtechnologie, Heinrich‐Heine‐Universität Düsseldorf) wurde die in vivo Anwendbarkeit der synthetisierten photocaged Induktoren in Gram-negativen sowie Gram-positiven Bakterien demonstriert. Dabei wurden verschiedene Regulator/Promotor-Systeme unter Verwendung von photocaged Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid-, Arabinose- und Salicylsäure-Derivaten erfolgreich lichtgesteuert aktiviert. In Escherichia coli konnten die Regulator/Promotor-Kombinationen LacI/PT7, AraC/PBAD und NagR/PnagAa kontrolliert werden. Des Weiteren wurden im Organismus Pseudomonas putida die LacI/Ptac und NagR/PnagAa, Systeme sowie die IPTG-induzierbaren Promotoren Pgrac in Bacillus subtilis und PT7 im anoxygenen phototrophen Organismus Rhodobacter capsulatus lichtgesteuert reguliert. Abschließend konnte in P. putida durch Kombination von zwei photocaged Induktoren eine lichtgesteuerte wellenlängenselektive Genexpression etabliert und am Beispiel der Biosynthese von Mono- und Di-Rhamnolipiden demonstriert werden.Photocaged compounds are optochemical tools that enable the light-controlled release of biological effector molecules with high spatiotemporal resolution. As an orthogonal, external, and easily tuneable stimulus, light ensures non-invasive control of biological processes such as gene expression. The aim of this work was the development and in vitro characterisation of novel photolabile-protected small molecule inducers, which should enable simultaneous, wavelength-selective control over several biotechnologically relevant promoters. The initial focus was on the synthesis of photocaged compounds that should exhibit improved properties for application in microbial organisms. Inducers from the molecular classes of carbohydrates as well as aliphatic and aromatic carboxylic acids (propionic acid or else benzoic acid derivatives) were provided with a photolabile protecting group and optimised in an iterative process. The photocleavable protecting groups were either representatives of the o nitrobenzyl, coumarin-4-ylmethyl or trimethyl lock chromophores. The o nitrobenzyl-derived inducers were designed for exposure at 375 nm, whereas the (coumarin-4-yl)methyl- and trimethyl-lock-protected effector molecules were designed for excitation above 400 nm. Thus, a diverse library consisting of 30 photolabile-protected effector molecules was successfully prepared and their relevant parameters for in vivo application such as quantum yield as well as solubility and stability in aqueous media were determined. In a cooperation with M. Sc. Fabienne Hilgers (Institute of Molecular Enzyme Technology, Heinrich Heine University Düsseldorf) the in vivo applicability of the synthesised photocaged inducers in Gram-negative as well as Gram-positive bacteria was demonstrated. Different regulator/promoter systems were successfully activated in a light-controlled manner using photocaged isopropyl β-D-thiogalactopyranoside, arabinose and salicylic acid derivatives. In Escherichia coli, the regulator/promoter combinations LacI/PT7, AraC/PBAD and NagR/PnagAa were controlled. Furthermore, in the organism Pseudomonas putida, the LacI/Ptac and NagR/PnagAa, regulatory systems as well as the IPTG-inducible promoters Pgrac in Bacillus subtilis and PT7 in the anoxygenic phototrophic organism Rhodobacter capsulatus were regulated by irradiation. Finally, light-mediated wavelength-selective gene expression was established in P. putida by combining two photocaged inducers and demonstrated using the biosynthesis of mono- and di-rhamnolipids as an example. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Bioorganische Chemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 23.08.2022 | |||||||
| Dateien geändert am: | 23.08.2022 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 01.12.2021 | |||||||
| Datum der Promotion: | 10.05.2022 |
