Dokument: Identifizierung neuer Benzoylformiatdecarboxylasen durch Wachstum-basierte Selektion

Titel:	Identifizierung neuer Benzoylformiatdecarboxylasen durch Wachstum-basierte Selektion
Weiterer Titel:	Identification of novel benzoylformate decarboxylases by growth selection
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=6035
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20071022-141547-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Henning, Helge [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,14 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 12.10.2007 / geändert 12.10.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Sahm, Hermann [Gutachter]
Stichwörter:	Benzoylformiatdecarboxylasen
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Chirale 2-Hydroxyketone sind wichtige Vorstufen in der organischen Synthese (Dünkelmann et al., 2004). Das ThDP-abhängige Enzym Benzoylformiatdecarboxylase (BFD) aus Pseudomonas putida ATCC12633 ist als einziges bekanntes Enzym zur (S)-selektiven Katalyse von 2-Hydroxyketonen mittels Carboligase-Aktivität befähigt (Pohl et al., 2002; 2004). Jedoch weist es ein enges Substratspektrum bezüglich Acylakzeptor und Donoraldehyd auf (Dünnwald et al., 2000; Iding et al., 2000). In der vorliegenden Arbeit wurde ein Wachstum-basiertes Selektionssystem entwickelt und etabliert, mit dem es möglich ist, neue BFDs aus Genom- und Metagenom-Bibliotheken zu identifizieren. Besonders der Metagenomansatz birgt ein enormes Potential an bisher unbekannter genetischer Information und somit an neuen Enzymen, die industriell genutzt werden können (Lorenz & Eck, 2005). Anhand des neuen Selektionssystems ist es möglich, DNA-Bibliotheken auf effektive Art und Weise auf BFD-Aktivität zu durchmustern. Dies konnte durch die Identifizierung von drei neuen BFDs (BfdB, BfdC und BfdM) exemplarisch demonstriert werden. BfdB und BfdC stammen aus einer Genom-Bibliothek von P. putida ATCC12633, während BfdM aus einer Metagenom-Bibliothek isoliert wurde. BfdC konnte erfolgreich in E. coli exprimiert und aufgereinigt werden. Es besitzt trotz einer moderaten Homologie (63 %) ähnliche katalytische Eigenschaften wie die bereits ausführlich charakterisierte BfdA (MdlC) aus P. putida ATCC12633. So konnte für die BfdC sowohl Decarboxylase- als auch Carboligase-Aktivität nachgewiesen werden. Bei der Carboligation wird, wie bei der BfdA, aus Acetaldehyd und Benzaldehyd das (S)-2-HPP gebildet. Jedoch ist die Stereoselektivität der BfdC (ee 80 %) bei gleicher Substratkonzentration niedriger als bei der BfdA (ee 89 %; Iding et al., 2000). Ein Unterschied besteht bei der gemischten Carboligation von Acetaldehyd und substituierten Benzaldehyd. So setzt die in dieser Arbeit identifizierte BfdC die Ligation von Acetaldehyd und 3,5-Dimethoxybenzaldehyd wesentlich besser um als BfdA. Die BfdC könnte somit das Produktspektrum an 2-Hydroxyketonen, welches bislang durch die ThDP-abhängigen Enzyme PDC, BAL und BfdA gebildet wird (Pohl et al., 2002), erweitern und Synthons für die organische Chemie zur Verfügung stellen. Das Selektionssystem konnte erfolgreich zur Identifizierung von neuen BFDs angewendet werden. Zudem ist auch eine Anwendung zur Identifizierung anderer relevanter Enzym-Klassen denkbar, durch die ein großes Spektrum an interessanten Vorstufen für die chemische Industrie erschlossen werden kann. Chiral 2-hydroxy ketones are versatile building blocks for a variety of different fine chemicals in organic synthesis (Dünkelmann et al., 2004). To date, only the thiamine-diphosphate dependent benzoylformate decarboxylase (BFD) from Pseudomonas putida ATCC12633 is capable of (S)-selective catalysis of 2-hydroxy ketones by carboligation (Pohl et al., 2002; 2004). However, the BFD shows a narrow substrate specificity towards acceptor- and donor-aldehyde (Dünnwald et al., 2000; Iding et al., 2000). In the present work, a growth-dependent selection system for the identification of new BFDs in genome- and metagenome-libraries was constructed and established. The metagenome approach holds an enormous potential of unknown genetic information and new enzymes for industrial applications (Lorenz & Eck, 2005). Using this novel system, screening of DNA libraries for BFD activity is highly efficient, now. This efficiency could be demonstrated by the identification of three novel BFDs (BfdB, BfdC and BfdM). BfdB and BfdC originating from a chromosomal library of P. putida ATCC12633 and BfdM from an environmental DNA library. BfdC was successfully expressed in E. coli and purified. In spite of moderate homology (63 %), BfdC exhibits similar catalytic features as the well-known BfdA (MdlC) from P. putida ATCC12633. It was possible to proof decarboxylase and carboligase activities of BfdC. During carboligation reaction BfdC forms (S)-2-hydroxypropiophenone ((S)-2-HPP) from acetaldehyde and benzaldehyde, similar to BfdA. However, BfdC shows lower stereo-selectivity (ee 80 %) than BfdA (ee 89 %; Iding et al., 2000) at same substrate concentrations. In addition, both enzymes differ in efficiency of the mixed carboligation of acetaldehyde and substituted benzaldehyde and with respect to their product spectrum. BfdC, which was discovered in this work, catalyzes the ligation of acetaldehyde and 3,5-dimethoxybenzaldehyde more efficiently than BfdA. Thus, BfdC could extent the product spectrum of 2-hydroxy ketones, which are provided so far by the thiamine diphosphate dependent enzymes PDC, BAL and BfdA (Pohl et al., 2002) and yield interesting synthons for organic chemistry. The developed screening system was successfully used for the identification of novel BFDs. Furthermore, the identification of other relevant enzyme-classes is possible. Thus, a large spectrum of interesting precursors for chemical industry can be provided.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	12.10.2007
Dateien geändert am:	12.10.2007
Promotionsantrag am:	03.05.2007
Datum der Promotion:	27.06.2007