Dokument: The Presenilin-1-PEN-2 complex, the minimal catalytic subunit of the γ-secretase --Isolation and characterization of the tetrameric PS1-PEN-2 complex in E.coli

Titel:	The Presenilin-1-PEN-2 complex, the minimal catalytic subunit of the γ-secretase --Isolation and characterization of the tetrameric PS1-PEN-2 complex in E.coli
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=60240
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20220801-112645-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Tao, Chengcheng [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,74 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 21.07.2022 / geändert 21.07.2022
Beitragende:	Prof.Dr. Labahn, Jörg [Gutachter] Prof. Dr. Heise, Henrike [Gutachter]
Stichwörter:	γ-secretase, Presenilin-1-PEN-2 complex, Alzheimer’s disease
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Der γ-Sekretase-Komplex, bestehend aus Presenilin, PEN-2, Nicastrin (NCT) und APH-1, ist ein Multitransmembranprotein, der über 90 Typ-I-Membranproteinsubstrate verarbeitet. Der Komplex wurde als Aspartyl-Protease identifiziert, die eine zentrale Rolle bei der zellulären Regulation spielt. Die abnorme Spaltung des bekannten γ-Sekretase-Substrats Amyloid-Vorläuferproteine (APP) in neurotoxische Peptide führt zur Alzheimer-Krankheit. Trotz umfangreicher struktureller und funktioneller Untersuchungen des γ-Sekretase-Komplexes in den letzten Jahrzehnten sind der Mechanismus der Spaltung und die Rolle des Zusammenbaus des γ-Sekretase-Komplexes unklar. In dieser Arbeit wurde der PS1-PEN-2-Proteinkomplex durch Rekonstitution in Liposomen oder Koexpression in E.coli-Zellen gewonnen. Bei Rekonstitutionsversuchen in Liposomen wurde aufgrund des Einflusses des Detergens und des MBP-Tags keine Presnilinase-Aktivität beobachtet. Sowohl die Presenilinase- als auch die γ-Sekretase-Aktivitäten wurden in DIBMA-solubilisierten koexprimierten PS1-PEN-2-Lipid-Komplexen aufgrund der Auswirkungen der E.coli-Lipide nicht nachgewiesen. DDM-solubilisierte PS1-PEN-2-Proteinkomplexe wiesen ein hochmolekulares Oligomer und einen Tetramerkomplex mit einem Molekulargewicht von etwa 600 kDa bzw. 167 kDa auf. Der tetramerische Komplex wies PS1-NTF- und PS1-CTF-Fragmente auf, was das Vorhandensein von Presenilinase-Aktivität zeigt, so dass zum ersten Mal ein funktioneller γ-Sekretase-Subkomplex charakterisiert wurde. Die biophysikalische Charakterisierung des tetrameren PS1-PEN-2-Komplexes wurde mittels Zirkulardichroismus und Fluoreszenzspektroskopie durchgeführt. Der WT-Komplex und der mutierte DDAA-Komplex ohne die katalytischen Asparaginsäurereste wiesen ähnliche Sekundärstrukturen, aber unterschiedliche Tertiärstrukturen auf: Der WT-Komplex und der DDAA-Komplex zeigten eine ähnliche thermische Stabilität von etwa 62 °C (CD). Weiterhin zeigte FleBt-APH-1 eine höhere Bindungskonstante an den DDAA-Komplex (~33 nM) als an den WT-Komplex (~83 nM). NCT hingegen zeigte eine Dissoziationskonstante von ~783 nM für den WT-Komplex, aber ~272 nM für den DDAA-Komplex bei der Microscale Thermophoresis (MST). Diese Bindungskonstanten weisen darauf hin, dass der Aufbau der intakten γ-Sekretase aus dem minimalen katalytischen Subkomplex PS1-PEN-2 in der Reihenfolge APH-1, NCT erfolgen sollte. Die Aktivität des PS1-PEN-2-Proteinkomplexes mit 2:2-Stöchiometrie aus E.coli wurde mit einem fluorogenen γ-Sekretase-Substrat nachgewiesen. Mit dieser Probe konnte zum ersten Mal eine spezifische Aktivität des γ-Sekretase-Typs nachgewiesen und die Auswirkungen von Inhibitoren analysiert werden. Der WT-Komplex zeigte eine spezifische γ-Sekretase-Aktivität von 1,2E-4 U/mg mit einer Anfangsgeschwindigkeit von 6 µM/min. Der DDAA-Komplex hingegen wies eine spezifische γ-Sekretase-Aktivität von 8,3 E-5 U/mg bei einer Anfangsgeschwindigkeit von 3,5 µM/min auf. Der Differenz zwischen dem WT-Komplex und der DDAA-Mutante stellt die untere Grenze für γ-Sekretaseaktivität dar, die 3,9 E-5 U/mg beträgt. Auf der Grundlage des erhaltenen Komplexes ist es nun möglich, den molekularen Mechanismus der Produktion der neurotoxischen Peptide, die die Ursache der Alzheimer-Krankheit sind, anhand der Minimalkomplexe mit FAD-Mutationen zu untersuchen. The γ-secretase complex, consisting of Presenilin, PEN-2, Nicastrin (NCT) and APH-1, is a multi-transmembrane protein which processes over 90 type I membrane protein substrates. It had been identified as an aspartyl-protease with a central role in cellular regulation. The abnormal cleavage of the well-known γ-secretase substrate amyloid precursor proteins (APP) into neurotoxic peptides leads to Alzheimer's disease. Despite the extensive implementation of structural and functional studies on the γ-secretase complex in the past decades, the mechanism of cleavage and the role of assembly of the γ-secretase complex are unclear. In this work, the PS1-PEN-2 protein complex was obtained by reconstitution into liposomes or co-expression in E.coli cells. No Presnilinase activity was observed in reconstitution experiments into liposomes due to the influence of detergent and the MBP-tag. Both the Presenilinase and the γ-secretase activities were not detected in DIBMA solubilized co-expressed PS1-PEN-2-lipid complexes because of effects of the E.coli lipids. DDM-solubilized PS1-PEN-2 protein complexes displayed an oligomer and a tetramer complex with approximately molecular weight of 600 kDa and 167 kDa, respectively. The tetrameric complex showed PS1-NTF and PS1-CTF fragments, representing the presence of Presenilinase activity, therefore for the first time a functional γ-secretase subcomplex has been characterized. The biophysical characterization of the PS1-PEN-2 tetrameric complex was conducted by circular dichroism and fluorescence spectroscopy. The WT complex and the DDAA mutant complex without the catalytic aspartic acid residues exhibited similar secondary structures but different tertiary structures: The WT complex and the DDAA complex showed similar thermal stability of approximately 62 °C (CD). Additionally, FleBt-APH-1 showed higher binding constant to the DDAA complex (~33 nM) than to the WT complex (~83 nM). Whereas, NCT showed the dissociation constant of ~783 nM to the WT complex but ~272 nM to the DDAA complex by microscale thermophoresis (MST). These binding constants indicate that the assembly of intact γ-secretase from the minimal catalytic subcomplex PS1-PEN-2 should proceed in the order APH-1, NCT. The activity of the PS1-PEN-2 protein complex with 2:2 stoichiometry from E.coli was detected by using a fluorogenic γ-secretase substrate. This sample allowed for the first time detecting a specific activity of the γ-secretase type and analyze the effects of inhibitors. The WT complex showed the specific γ-secretase activity of 1.2E-4 U/mg with an initial velocity of 6 µM/min. Meanwhile the DDAA complex exhibited the specific γ-secretase activity of 8.3 E-5 U/mg with an initial velocity of 3.5 µM/min. The difference between the WT complex and the DDAA mutant would be the lower estimate of the γ-secretase activity, which is 3.9E-5 U/mg. Based on the obtained complex, it is now possible to study the molecular mechanism of the production of the neurotoxic peptides which are the root cause Alzheimer’s disease using the minimal complexes with FAD mutations.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	01.08.2022
Dateien geändert am:	01.08.2022
Promotionsantrag am:	26.04.2022
Datum der Promotion:	23.06.2022