Dokument: Entwicklung einer enzymatischen Kaskade für die Synthese von Strictosidin in vitro
| Titel: | Entwicklung einer enzymatischen Kaskade für die Synthese von Strictosidin in vitro | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=59877 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20220620-110932-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Weber, Christopher [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Urlacher, Vlada B. [Gutachter] Prof. Dr. Pietruszka, Jörg [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | Terpenindolalkaloide (TIA) sind pflanzliche Sekundärmetaboliten, die aufgrund ihrer ausgesprochen hohen Substanz- und Strukturvielfalt und durch ihre nicht selten interessanten oder gar einzigartigen Wirkungseigenschaften große phamakologische Relevanz besitzen. Eine Besonderheit bei der Biosynthese fast aller bekannten TIA ist die Rolle von Strictosidin als universelle Vorstufe.
Aus biokatalytischer Sicht sind nur wenige Details über die Interaktion der Enzyme bekannt, welche die Schritte unmittelbar vor Strictosidin katalysieren. Insbesondere CYP72A1 aus Catharanthus roseus, die eine ungewöhnliche Öffnung des Loganin-Fünfrings katalysiert, wurde bisher nicht biochemisch charakterisiert. Das liegt vorwiegend daran, dass pflanzliche Cytochrom-P450-Monooxygenasen (P450) und ihre Redoxpartner (RP) Transmembranproteine sind. Dadurch stellt eine heterologe Produktion der Enzyme in einer aktiven und löslichen Form – neben der Handhabung – eine Herausforderung dar. Auch aufgrund der Schlüsselstellung der CYP72A1 ist eine biokatalytische Charakterisierung der P450 von besonderer Relevanz. Die katalysierte Umwandlung von Loganin ist ein wahrscheinlicher Engpass (Bottleneck) der TIA-Biosynthese und CYP72A1 ist die letzte P450, bevor die TIA-Biosynthese durch Deglycosylierung von Strictosidin in verschiedene Reaktionszweige divergiert und dabei eine außerordentlich große Strukturvielfalt erzeugt wird. In der vorliegenden Arbeit wurde die CYP72A1 durch Protein-Engineering in Escherichia coli in löslicher Form hergestellt und isoliert. Anschließend wurden kompatible RP identifiziert und die katalytische Aktivität gegenüber Loganin in vitro rekonstituiert. CYP72A1 wurde mit bakteriellen RP, einem Flavodoxin YkuN aus Bacillus subtilis und einer Flavoxodin-Reduktase FpR aus E. coli, einer biochemischen Charakterisierung unterzogen. Aus der katalytischen Aktivität der LAMT, CYP72A1, STR und drei weiteren Enzymen wurde eine in vitro Kaskade zur Umwandlung von Loganinsäure zu Strictosidin etabliert. Es wurden verschiedene Reaktionsparameter einer Durchmusterung unterzogen, um die Ausbeute der Reaktionsfolge zu optimieren. Im Zuge dieser Untersuchung wurde demonstriert, dass die Aktivität der CYP72A1 ein wichtiger limitierender Faktor für die Strictosidin-Ausbeute aus der Reaktionsfolge ist. Die vorliegende Arbeit und die resultierenden Erkenntnisse leisten einen wichtigen Beitrag für zukünftige Arbeiten an der pharmakologisch relevanten biokatalytischen Synthese von TIA. Die etablierte Kaskade bietet ein wertvolles Werkzeug zur Erforschung und Optimierung biokatalytischer TIA-Synthesen und kann als Basis zur Erschließung alternativer Syntheserouten herangezogen werden.Terpenoid indole alkaloids (TIA) are plant secondary metabolites with a high pharmacological relevance due to the large variety of substances and structures, but also because of their often interesting or even unique pharmacological properties. A special characteristic during the biosynthesis of almost all known terpenoid indole alkaloids is the role of strictosidine as a universal precursor. However, from a biocatalytic perspective, few details are known about the interaction of the enzymes that catalyse the steps immediately before strictosidine is generated. In particular, CYP72A1 from Catharanthus roseus, which catalyses an unusual opening of the loganin five-membered ring, has not been biochemically characterised so far. A main reason is the fact that plant cytochromes P450 and their redox partners are transmembrane proteins and therefore handling and heterologous production in an active and soluble state can be challenging. CYP72A1 is of special relevance as it is a potential bottleneck for the TIA-biosynthesis and the last P450 before TIA-biosynthesis is initiated by the deglycosylation of strictosidine. In the steps following strictosidine, TIA-biosynthesis diverges into different reaction branches and vast structural diversity is introduced. In the present work, a part of the strictosidine biosynthesis from C. roseus starting from loganic acid was reconstituted in vitro. CYP72A1 was expressed in Escherichia coli after protein engineering of the membrane bound N-terminal region. Compatible redox partners, the flavodoxin YkuN from Bacillus subtilis and the flavodoxin reductase FpR from E. coli, were identified and the catalytic activity towards loganin was reconstituted in vitro. The P450 was subjected to biochemical characterization. From the catalytic activity of loganic acid O-methyltransferase, CYP72A1, strictosidine synthase and three additional enzymes an in vitro cascade was established for the conversion of loganic acid to strictosidine. Various reaction parameters were screened to optimize the yield of the reaction sequence. It was demonstrated that the activity of CYP72A1 is an important limiting factor for the strictosidine yield from this sequence of reactions. The presented work and the resulting findings offer a significant contribution for future work on the biocatalytical synthesis of TIA. The cascade can be utilized as a tool to research and optimize existing strictosidine syntheses and to develop alternative or new synthetic routes. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 20.06.2022 | |||||||
| Dateien geändert am: | 20.06.2022 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 07.09.2021 | |||||||
| Datum der Promotion: | 09.05.2022 |
