Dokument: Messengers Outer Space: Exploring Extracellular Vesicles of Ustilago maydis and their mRNA Cargo
| Titel: | Messengers Outer Space: Exploring Extracellular Vesicles of Ustilago maydis and their mRNA Cargo | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=59747 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20220610-104151-8 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr. Kwon, Seomun [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Feldbrügge, Michael [Gutachter] Prof. Dr. Rose, Laura [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Extracellular Vesicles, mRNA, Phytopathology, Fungal Pathogen | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Extrazelluläre Vesikel (EVs) gewinnen zunehmend Bedeutung als wichtigen Vehikel für die molekulare Interaktionen zwischen Pflanzen und Pathogenen. Die Untersuchung der Frachtmoleküle von EVs, die von phytopathogenen Pilzen produziert werden, birgt das Potenzial, neue Arten von Effektoren zu entdecken, die die Physiologie der Wirtspflanze zum Nutzen des Pathogens manipulieren. In dieser Pionierarbeit über EVs aus dem Maisbeulenbrandpilz Ustilago maydis wird die Untersuchung von EV-assoziierten mRNAs vorgestellt. Das Projekt fußt auf der Hypothese, dass intakte pilzliche mRNAs durch EVs in Pflanzenzellen transportiert werden können, wo sie mittels Wirtsressourcen translatiert werden, um Effektorproteine zu produzieren. Die Strategie bestand darin, zunächst die EVs von U. maydis aus axenischen Kulturen zu untersuchen, um anschließend zu komplexeren Proben aus infiziertem Pflanzenmaterial überzugehen. Um die für die Infektion relevanten EV-Fracht zu identifizieren, wurde ein synthetischer Stamm verwendet, bei dem bekannte Effektoren und infektionsassoziierte Gene in axenischer Kultur induziert werden können. Eine hoch reproduzierbare Methode zur Isolation von EVs aus diesen induzierten U. maydis Kulturen wurde entwickelt. Mit dieser wurde ein Inventar von EV-assoziierten mRNAs erstellt. Dieses axenische U. maydis Kultursystem ermöglichte erste Einblicke in die selektive Beladung und Funktionalität von EV-Fracht-mRNAs. In den aus der Kultur stammenden EVs wurden mRNAs bekannter Virulenzproteine gefunden, was das Potenzial unterstützt, mit dieser Strategie neue virulenzassoziierte mRNAs zu entdecken. Es wurden weiterhin mehrere, funktionell interessante mRNA-Effektorkandidaten identifiziert, die sowohl in EVs angereichert, als auch während der Infektion hochreguliert sind. Wichtig ist, dass intakte mRNAs in voller Länge für alle getesteten Kandidaten nachgewiesen werden konnten, sodass sie theoretischin von der Pflanzenzelle in funktionelle Proteine translatiert werden könnten. Stoffwechselenzym-kodierende mRNAs waren in EVs besonders angereichert, was darauf hindeutet, dass ein einzelnes in die Wirtszelle übertragenes und translatiertes Pilz-mRNA-Molekül potentiell tiefgreifende Auswirkungen auf die Wirtsphysiologie haben könnte. Zur Untersuchung der während der Infektion von U. maydis produzierten EVs, wurden Methoden zur EV-Isolation aus apoplastischer Waschflüssigkeit infizierter Maispflanzen angewandt. Zur Visualisierung und Anreicherung von Pilz-EVs aus infiziertem Pflanzenmaterial, wurde ein Marker für U. maydis-EVs entwickelt. Mit diesem Marker konnte die Produktion von EV-ähnlichen Strukturen in planta beobachtet werden. Mit den in dieser Arbeit entwickelten Werkzeugen und Methoden ist es nun möglich, das Transkriptom und Proteom von EVs zu untersuchen, die aus axenischer Kultur und aus infizierten Pflanzen gewonnen wurden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten und Methoden sollten als Grundlage für künftige Studien über U. maydis-EVs und ihre Rolle bei der Interaktion mit der Wirtspflanze dienen.Extracellular vesicles (EVs) are emerging as important vehicles for molecular plant-pathogen interactions. Examining cargo molecules of EVs produced by phytopathogenic fungi has the potential to discover novel types of effector molecules that alter host plant physiology for the benefit of the pathogen. Presented in this thesis is a pioneering investigation on EV-associated mRNAs from the maize smut fungus Ustilago maydis. The project was driven by the original hypothesis that intact fungal mRNAs can be delivered to plant cells via EVs, where they are translated to produce effector proteins using host resources. The strategy was to first study U. maydis EVs from axenic culture, then proceed to more complex samples from infected plants. In order to identify EV cargos that are more relevant for infection, a synthetic strain was utilised, where a set of known effectors and infection-associated genes can be induced in axenic culture. A highly reproducible method was established for preparing EVs from such induced cultures of U. maydis, resulting in an inventory of EV-associated mRNAs. Initial insights on selective loading and functionality of EV cargo mRNAs could be gained from the U. maydis axenic culture system. mRNAs of known virulence proteins were found in the culture-derived EVs, supporting the potential to discover novel virulence-associated mRNAs with this strategy. Several functionally interesting candidate mRNA effectors were identified, that are both enriched in EVs and highly upregulated during infection. Importantly, the top candidate mRNA effectors tested were intact, so they could theoretically be translated into functional proteins in the plant cell. mRNAs encoding proteins with metabolic enzyme activities were especially enriched in EVs, so a single fungal mRNA molecule delivered and translated could produce profound effects in the host cell. For studying U. maydis EVs produced during infection, a method was developed to isolate EVs from the apoplastic washing fluid of infected maize plants. Furthermore, a tagged syntaxin marker was designed for U. maydis EVs for visualisation and purification from infected plant materials. Using this marker, production of EV-like structures could be observed in planta. With the tools and methods developed in this thesis, it is now possible to cross-examine the transcriptome and proteome of both axenic culture-derived EVs and EVs from infected plants to identify high-confidence, biologically interesting cargos for in-depth investigations. The data and methods presented in this thesis should serve as a foundation for future studies on U. maydis EV cargos and their role in interaction with the host plant. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 10.06.2022 | |||||||
| Dateien geändert am: | 10.06.2022 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 14.12.2021 | |||||||
| Datum der Promotion: | 02.03.2022 |
