Dokument: Generierung und Charakterisierung von Alzheimer-Antikörpern gegen Amyloid-β im Rahmen der Alzheimer-Erkrankung
| Titel: | Generierung und Charakterisierung von Alzheimer-Antikörpern gegen Amyloid-β im Rahmen der Alzheimer-Erkrankung | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=59489 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20220516-075205-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Zittlau, Aaron Raphael [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. med. Korth, Carsten [Gutachter] Prof. Dr. med. Sabel, Michael [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Alzheimer, Abeta, monokonale Antikörper | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Neben den klinischen Charakteristika wie Verlust mnestischer und kognitiver Fähigkeiten finden sich bei Morbus Alzheimer distinkte histopathologische Veränderungen. Fokus der Untersuchungen liegt hierbei auf dem Amyloid-β-Protein (Aβ), welches der Amyloid-Kaskaden-Theorie nach zufolge durch Aggregation über Oligomere zur Bildung von extrazellulären Plaques und letztendlich Inflammation neuronalen Gewebes und dessen Untergang führen soll. Es zeigte sich, dass die Quantität der unlöslichen Plaques nicht mit dem klinischen Ausmaß der Erkrankung korreliert. Viel mehr fanden sich lösliche Aβ-Spezies, deren Auftreten mit neurotoxischen Prozessen einhergeht. Die kleinste Einheit unter den löslichen Aβ-Oligomeren stellen die Aβ-Dimere dar. Ziel dieser Arbeit war es, Antikörper gegen Aβ bzw. konformationsspezifische Antikörper gegen Aβ-Dimere zu generieren. Nach Immunisierung zweier Mäuse mit zuvor stabilisiertem S8C-Aβ-Dimer erfolgte die Generierung immortalisierter antikörperproduzierender Hybridomazellen. Insgesamt konnten aus der Fusion 490 Klone gewonnen werden, worunter in einem ersten Screening mittels ELISA 115 auf Aβ-Dimer positiv reagierende identifiziert werden konnten. Zur Differenzierung zwischen konformationsspezifischen und -unspezifischen Antikörpern erfolgten weitere Testungen mittels ELISA. Drei der monoklonalen Antikörper (4H8, 7A12, 17F4.G9) mit der auffälligsten Bindungsstärke wurden genauer auf ihre Eigenschaften untersucht. 4H8 und 7A12 zeigten in der Immunpräzipitation (IP) eine spezifische Affinität zu dimerem S8C-Aβ. Im direkten Aβ-Nachweis zeigten die Klone für synthetisches Aβ eine unspezifische Bindung, wobei 4H8 eine höhere Affinität für dimeres und 7A12 eine höhere Affinität für monomeres Aβ besaß. Bei zellulär sekretiertem Aβ zeigte sich eine spezifische Bindung an monomeres Aβ. Ursächlich hierfür können posttranslationale Modifikationen am Aβ sein oder auch die Freilegung von zuvor verdeckten Epitopen durch Denaturierungsprozesse. 17F4.G9 zeigte sowohl in der IP als auch im direkten Aβ-Nachweis eine unspezifische Bindung an Aβ-Monomere und -Dimere. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Zielsetzung der Arbeit grundlegend erfüllt wurde. Weitere Untersuchungen der Klone und Wiederholungen von Testungen sind weiterhin von Nöten, wobei diese durch eine per se gegebene Instabilität der Klone und irreversible Verluste bei Subklonierungen einer natürlichen Limitation unterliegen. Diese Antikörper könnten als medizinische Biomarker diagnostisch zum frühzeitigen Nachweis einer Alzheimererkrankung oder therapeutisch zur Limitation der Erkrankung eingesetzt werden. Des Weiteren ist es möglich die funktionale Bedeutung der Aβ-Dimere im Verlauf der Alzheimererkrankung zu definieren.Next to clinical characteristics as loss of mnestic and cognitive functions as well as progressive decline in the ability of handling everyday life, there are distinct histopathological hallmarks in Alzheimer’s disease, the most common cause of dementia. The focus of research regarding these is lying on the amyloid-β-protein (Aβ). A protein which, according to the amyloid-cascade-theory, leads through fibril aggregation into oligomers to insoluble Aβ-plaque formation and inflammation and damage of neurological tissue. It was shown that the quantity of insoluble plaques did not correlate with the clinical extent of the disease. However, the presence of newly found soluble toxic Aβ-species correlates with neurotoxic processes. The smallest unit among the Aβ-species are Aβ-dimers. Goal of this thesis was firstly to generate antibodies against Aβ and secondly conformation specific antibodies against S8C-Aβ-dimers. After immunizing two mice with stabilized S8C-Aβ-dimers, their splenocytes were fused with melanoma cells to generate immortalized antibody producing hybridoma cells. Overall, 490 clones were won. Among these, 115 were tested positive for S8C-Aβ in a first screening ELISA. For further differentiation between conformation specific and non-specific antibodies additional ELISA tests were performed. Three monoclonal antibodies (4H8, 7A12, 17F4.G9) with exceptional affinity were selected and further characterized. 4H8 and 7A12 showed a specific affinity to S8C-Aβ in immunoprecipitations (IPs). In tests where Aβ is directly detected by the clones, a non-specific binding affinity to synthetic Aβ was shown. Yet, 4H8 showed a higher affinity to dimers, while 7A12 showed a higher one for monomers. In the same procedure done with cellular secreted Aβ both clones showed a specific affinity to monomeric Aβ. This might be a result of posttranslational modification or due to protein denaturation where covered epitopes could be exposed. 17F4.G9 showed a non-specific binding to Aβ-monomers and -dimers in IPs as well as in direct detection experiments of Aβ. In conclusion, the main goal of this thesis was basically fulfilled. Supplementary characterizations, e.g. epitope mapping, or repetition of experiments are still necessary. However, this might be subjected to a natural limitation due to a given instability of the clones or an irreversible loss while subcloning. The antibodies might help as a diagnostic or therapeutic tool do detect Alzheimer’s disease in an early stage or to limit the progress all in all. Furthermore, they might lead to better understanding of the functional role of Aβ during the course of Alzheimer’s disease. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Neuropathologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 16.05.2022 | |||||||
| Dateien geändert am: | 16.05.2022 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 28.08.2021 | |||||||
| Datum der Promotion: | 28.04.2022 |
