Dokument: Fluoreszenzbasierte Systeme zum Nachweis der Produktion und Sekretion von Proteinen in Bacillus subtilis

Titel:	Fluoreszenzbasierte Systeme zum Nachweis der Produktion und Sekretion von Proteinen in Bacillus subtilis
Weiterer Titel:	Fluorescence-based systems for detection of protein production and secretion in Bacillus subtilis
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=59414
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20220427-131538-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Lenz, Patrick [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,20 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 24.04.2022 / geändert 24.04.2022
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Univ. Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das Gram-positive Bakterium Bacillus subtilis ist ein gut etablierter Wirt, der in biotechnologischen Produktionsprozessen für die Synthese und Sekretion von rekombinanten Proteinen eingesetzt wird. Um dem stetig wachsenden Bedarf an mikrobiellen Proteinen gerecht zu werden, müssen diese immer effizienter produziert werden. Dies kann durch Optimierungskampagnen wie etwa dem Signalpeptid-Screening im Falle der Sekretionsoptimierung erreicht werden. Da bei solchen Kampagnen zahlreiche Varianten getestet werden, sollte das Zielprotein über ein sogenanntes Hochdurchsatz-Screening einfach nachweisbar und quantifizierbar sein. Dies erfolgt häufig aktivitätsbasiert über die enzymatische Bildung von photo- oder fluorometrisch detektierbaren Produkten. Da nicht für alle Zielproteine solche Aktivitätsassays zur Verfügung stehen, werden immer öfter aufgrund der simplen Auslesbarkeit fluoreszenzbasierte in vivo Nachweismethoden genutzt, bei denen die Produktion eines Fluoreszenzreporters an die Zielproteinsynthese gekoppelt wird. Daher wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein aktivitätsunabhängiges, fluoreszenzbasiertes System entwickelt, das Split GFP-basiert die Detektion von intra- und extrazellulären Zielproteinen und die Messung von Sekretionsstress über einen transkriptionsfaktorbasierten Biosensor ermöglicht. Für den Split GFP Assay wird das elfte β-Faltblatt von GFP (GFP11-Tag) an ein Zielprotein fusioniert, welches ein verkürztes, nicht fluoreszierendes GFP (GFP1-10, auch als Detektor bezeichnet) zu fluoreszierendem holo-GFP ergänzen kann. Zu Beginn konnte im Rahmen der Arbeit am Beispiel der β-Glukuronidase aus Escherichia coli (GUS11) gezeigt werden, dass der Split GFP Assay für die in vitro Detektion intrazellulärer Zielproteine grundsätzlich einsetzbar ist. Um eine in vivo-Detektion intrazellulärer Zielproteine zu ermöglichen, wurde anschließend der Detektor optimiert. Durch die Koexpression des modifizierten Detektors und GUS11 konnte anschließend gezeigt werden, dass dieser Split GFP-basierte Sensor für die online Überwachung intrazellulärer Zielproteine während der Kultivierung von B. subtilis eingesetzt werden kann. Zusätzlich konnte mit diesem Split GFP Assay die Heterogenität der GUS11-Produktion innerhalb der B. subtilis Population auf Einzelzellebene analysiert werden. Basierend auf dem Split GFP-Sensorsystem konnte zudem ein in vivo Verfahren zur einfachen Detektion sekretierter Zielproteine am Beispiel der Cutinase aus Fusarium solani pisi (Cut11) erfolgreich etabliert werden. Bei diesem Split GFP-basierten Nachweis bleibt der durch die Sekretion des Zielproteins entstehende zelluläre Stress jedoch unberücksichtigt. Daher wurden anschließend auf Grundlage des CssRS Zweikomponentensystem transkriptionsfaktorabhängige Sekretionsstress-Biosensoren mit sfGFP bzw. mCherry als Fluoreszenzreporter etabliert. Mithilfe dieser Biosensoren konnte beobachtet werden, dass die zelluläre Stressantwort nicht mit der sekretierten und aktiven Zielproteinmenge im extrazellulären Raum korreliert. Um dieses Phänomen weiter zu untersuchen, wurde anschließend der mCherry-Stresssensor mit dem Split GFP-basierten Sekretionssensor kombiniert. Mit dieser Kombination war es erstmals möglich, aktivitätsunabhängig und im Hochdurchsatz die Sekretion der Cut11 durch eine Translationsinitiationsoptimierung und ein Signalpeptid-Screening zu optimieren. Interessanterweise konnten so Varianten identifiziert werden, die zu einer verbesserten Sekretion bei gleichzeitig geringem Stresslevel führten. Um die entwickelten Biosensoren zu einem Drei-Sensor-Nachweissystem miteinander kombinieren zu können, wurden anschließend Detektorvarianten mit veränderten Fluoreszenzfarben entwickelt. Durch die veränderten Emissionswellenlängen konnte der blau fluoreszierende P4-Detektor für die intrazelluläre und der grün fluoreszierende GFP-Detektor für die extrazelluläre Detektion eingesetzt und mit dem roten mCherry-Sekretionsstressbiosensor kombiniert werden. Mit diesem kombinierten System konnte die Cut11-Sekretion in Abhängigkeit der Signalpeptide SPPel, SPEpr und SPBsn, umfassend analysiert werden. Es zeigte sich, dass trotz ähnlicher extrazellulärer Cut11-Aktivitäten unterschiedliche intrazelluläre Cut11-Level und Sekretionsstress-Antworten messbar waren. In diesem Kontext führte SPPel-Cut11 zu den stärksten intrazellulären und Stress-Signalen, was auf eine sehr geringe Sekretionseffizienz hindeutet. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit drei fluoreszenzbasierte in vivo Nachweissysteme für die Produktion und Sekretion von Proteinen in dem industriell relevanten Organismus B. subtilis entwickelt und anschließend auch kombiniert werden. Das dabei entstandene Drei-Sensor-System ermöglichte erstmalig eine umfassende, in vivo anwendbare und Zielprotein-unabhängige Analyse der (rekombinanten) Sekretion und ihrer Effizienz, was die Durchführung von zukünftigen Optimierungskampagnen für neue Zielproteine deutlich vereinfachen könnte. The Gram-positive bacterium Bacillus subtilis is a well-established host used in biotechnological production processes for the synthesis and secretion of recombinant proteins. To meet the growing demand for microbial proteins, they must be produced more efficiently. This can be achieved by optimization campaigns such as signal peptide screenings in the case of secretion optimization. Since numerous variants are tested in such campaigns, the target protein should be easily detectable and quantifiable with so-called high-throughput screenings. This is often done activity-based by the enzymatic formation of photo- or fluorometrically detectable products. Since such activity assays are not available for all target proteins, fluorescence-based in vivo detection methods, in which the production of a fluorescent reporter is coupled to the target protein synthesis, are increasingly used due to their simple read out. Therefore, in the present work, an activity-independent system was developed that allows split GFP-based detection of intracellular and extracellular target proteins and measurement of secretion stress with a transcription factor-based biosensor. For the split GFP assay, the eleventh β-sheet of GFP (GFP11 tag) is fused to a target protein. This tag can complement a truncated, non-fluorescent GFP (GFP1-10 also designated as detector) to fluorescent holo-GFP. In this work, using the β-glucuronidase from Escherichia coli (GUS11) as a model enzyme, it could first be demonstrated that the split GFP assay can in principle be used for the in vitro detection of intracellular target proteins. To enable in vivo detection of target proteins, the detector was further optimized. Co-expression of the modified detector and GUS11 demonstrated that this split GFP-based sensor can be used for online monitoring of intracellular target proteins during cultivation of B. subtilis. Furthermore, this split GFP assay allowed the analysis of heterogeneity of GUS11 production within the B. subtilis population at the single-cell level. Based on the split GFP sensor system, an in vivo method for simple detection of secreted target proteins was also successfully established using cutinase from Fusarium solani pisi (Cut11) as an example. However, this split GFP-based detection does not take into account the cellular stress resulting from the secretion of the target protein. Therefore, transcription factor-dependent secretion stress biosensors were established based on the CssRS two-component system using sfGFP and mCherry as fluorescence reporters, respectively. Using these biosensors, it was observed that the cellular stress response did not correlate with the secreted and active target protein levels in the extracellular space. To further investigate this phenomenon, the mCherry stress sensor was combined with the split GFP-based secretion sensor. With this combination, it was possible for the first time to optimize Cut11 secretion in an activity-independent, high-throughput manner using translation initiation optimization and signal peptide screening. Interestingly, this allowed the identification of variants that led to improved secretion while maintaining low stress levels. To combine the developed biosensors into a three-sensor detection system, subsequent detector variants with altered fluorescence colors were developed. The altered emission wavelengths allowed the combination of the blue fluorescent P4 detector for intracellular detection and the green fluorescent GFP detector for extracellular detection with the red mCherry secretion stress biosensor. The application of this combined system allowed the detailed analysis of Cut11 secretion mediated with the signal peptides SPPel, SPEpr, and SPBsn. It was found that despite similar extracellular Cut11 activities, different intracellular Cut11 levels and secretion stress responses were measurable. In this context, SPPel-Cut11 resulted in the strongest intracellular and stress signals, indicating very low secretion efficiency. In summary, in this work, three fluorescence-based in vivo detection systems for protein production and secretion in the industrially relevant organism B. subtilis were developed and subsequently combined. The resulting three-sensor system allowed for the first time a comprehensive, in vivo applicable and target protein-independent analysis of (recombinant) secretion and its efficiency, which will significantly simplify the implementation of future optimization campaigns for new target proteins.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	27.04.2022
Dateien geändert am:	27.04.2022
Promotionsantrag am:	08.02.2022
Datum der Promotion:	25.03.2022