Dokument: Approaches to replace the HlyA T1SS by homologs

Titel:	Approaches to replace the HlyA T1SS by homologs
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=59220
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20220411-110938-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Spitz, Olivia [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 32,55 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 30.03.2022 / geändert 30.03.2022
Beitragende:	Prof. Dr. Lutz Schmitt [Gutachter] Prof. Dr. Hegemann, Johannes [Gutachter]
Stichwörter:	HlyA T1SS
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Typ I Sekretionssysteme (T1SS) sind weit verbreitet unter Gram-negativen Bakterien aufgrund ihrer einfachen dreiteiligen Architektur. Zwei Proteine, die in der inneren Membran lokalisiert sind, ein ABC Transporter und ein Membranfusionsprotein (MFP), formen einen durchgängigen Kanal über beide Membranen zusammen mit einem Protein der äußeren Membran. Die Bildung des Kanals wird durch das Substrat induziert, welches in einem Ein-Schritt Mechanismus und C-Terminus zuerst in den extrazellulären Raum transportiert wird. Unterschiede, die die ABC Transporterdomänen betreffen, führten zu der Identifikation von vier Untergruppen von T1SS von welchen Gruppe 2 bisher die meisten identifizierten Mitglieder hat. Das am besten untersuchte System aus der Gruppe 2, das HlyA T1SS von E. coli, ist der Hauptfokus dieser Arbeit. Basierend auf in silico Analysen und Ähnlichkeit zu den HlyA T1SS Komponenten wurden 25 Gruppe 2 T1SS von verschiedenen Gram-negativen Bakterien identifiziert und in unterschiedlichem Ausmaß analysiert. Fünf ABC Transporter von diesen homologen Systemen wurden erfolgreich in verschiedenen E. coli Stämmen expremiert und für drei von diesen wurden Reinigungsprotokolle etabliert. Sekretionsexperimente mit diesen homologen Transportern und chimären ABC Transportern haben die Wichtigkeit der Nukleotidbinde- und Transmembrandomäne für die Komplexbildung und darauffolgende Sekretion hervorgehoben. Diese Experimente wurden unterstützt durch domänen- und gruppenspezifische Sequenzalignments von beiden Komponenten in der inneren Membran, welche zusätzliche Ähnlichkeiten innerhalb der Gruppen von T1SS aufdeckten und die Identifikation von zwei einzigartigen Motiven in den MFPs von Gruppe 2 erlaubten. Außerdem wurden zwei bereits vorgeschlagene amphipathische Helices bestätigt: Eine in der zytosolischen Domäne des MFPs HlyD und eine im Sekretionssignal des Substrates HlyA. Für die Letztere wurden zwei mögliche Bindetaschen in der Nukleotidbindedomäne des dazugehörigen ABC Transporters HlyB identifiziert. Type 1 secretion systems (T1SSs) are wide spread among Gram-negative bacteria due to their simple tripartite architecture. Two proteins located in the inner membrane, an ABC transporter and a membrane fusion protein (MFP), form one continuous channel across both membranes together with an outer membrane protein. Channel formation is induced by the substrate, which is transported in a one-step mechanism and C-terminus first to the extracellular space. Differences concerning the ABC transporter domains led to the identification of four subgroups of T1SSs of which group 2 holds the most identified members so far. The most investigated system of this group 2, the HlyA T1SS from E. coli, is the main focus of this work. Based on in silico analysis and similarity to the HlyA T1SS components 25 group 2 T1SSs from different Gram-negative bacteria were identified and analyzed to different extents. Five ABC transporters from these homologous systems were successfully expressed in different E. coli strains and purification protocols for three of these were established. Secretion experiments with these homologous transporters and chimeric ABC transporters highlighted the importance of the nucleotide binding and transmembrane domains for complex formation and subsequent secretion. These experiments were supported by domain- and group-specific alignments of both inner membrane components, which revealed additional similarities within the groups of T1SSs and allowed the identification of two unique motifs in the MFPs of group 2. Furthermore, two already proposed amphipathic helices were confirmed: one in the cytosolic domain of the MFP HlyD and one in the secretion signal of the substrate HlyA. For the latter, two possible binding pockets were identified in the nucleotide binding domain of the dedicated ABC transporter HlyB.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	11.04.2022
Dateien geändert am:	11.04.2022
Promotionsantrag am:	20.07.2021
Datum der Promotion:	12.10.2021