Dokument: Nonsense-mediated mRNA decay: defense mechanism against viral infections and its interference with HIV-1

Titel:	Nonsense-mediated mRNA decay: defense mechanism against viral infections and its interference with HIV-1
Weiterer Titel:	Nonsense-mediated mRNA decay: Abwehrmechanismus vor viralen Infektionen und die Wechselwirkung mit HIV-1
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=59088
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20220325-100536-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	M.Sc. Walotka, Lara Andrea [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,98 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 14.03.2022 / geändert 14.03.2022
Beitragende:	Prof. Dr. Schaal, Heiner [Gutachter] Prof. Dr. Feldbrügge, Michael [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	The cellular nonsense-mediated decay (NMD) pathway detects and degrades mRNAs with unusual structural features, such as long 3’ UTRs or overlapping reading frames. Many of which are found in viral transcripts, shedding light on NMD as a possible antiviral defense mechanism. This work focused on the interplay of the human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and the NMD machinery, including the analysis of HIV-1 transcripts and their sensitivity to NMD-mediated degradation, as well as potential infection-based modulations of the NMD machinery. The results of this work showed that HIV-1 transcripts were indeed targeted for degradation by NMD, specifically the mRNAs of the 2kb class. This NMD-sensitivity was independent of the number of splicing events and thus presumably the deposited exon-junction complexes (EJCs). Furthermore, transcript modifications, like shortening of the 3’ UTR, or re-introduction of the rev-responsive element (RRE), did not resolve this sensitivity. However, insertion of the well-described cis-acting Rous-sarcoma RNA stability element (RSE) into the 3’ UTR stabilized HIV-1 transcripts and confirmed the initially observed NMD-sensitivity of these viral mRNAs. Furthermore, in addition to the observed NMD-sensitivity of HIV-1 transcripts, the overall translation dependency of NMD-mediated target degradation was investigated, as some viral mRNAs with mutated translational start codon showed sensitivity to NMD-mediated degradation. Using a dualluciferase NMD reporter, the results demonstrated that the intrinsic strength of the translational start codon not only had an impact on the total amount of mRNA but also affected the NMD-sensitivity of a given reporter transcript. Therefore, NMD, in general, remains a translationdependent process, but transcripts with NMD-triggering features might escape recognition and degradation by maintaining low levels of translation via inefficient translation initiation. Therefore, in contrast to the tat mRNA, some viral transcripts with suboptimal Kozak sequence surroundings, like HIV-1 rev, vpu, and vpr might escape NMD. As HIV-1 transcripts were targeted by NMD, subsequent analysis of potential infection-based interference with the cellular NMD machinery illustrated the complexity of simple-looking NMD reporter systems. Based on alternative splicing events, it was shown that the widely used triosephosphate isomerase (TPI) NMD reporter was already a target of the NMD pathway even without an inserted pre-mature stop codon. Therefore, the expression of this reference had to be rendered NMD independent, which was achieved by modulations of the splice site strengths, generating a reliable system with a single splice isoform. However, neither transient transfection experiments with the modified TPI NMD reporters nor lentiviral-transduced cells expressing the dualluciferase NMD reporter system revealed an impact of HIV-1 infection on the NMD activity. Even though it is known that viral infections induce an interferon (IFN) response, and the results of this work suggested that recombinant IFNs can inhibit the cellular NMD machinery, HIV-1 infection neither resulted in enhanced expression of interferon-stimulated genes (ISGs) nor the accumulation of cellular NMD targets, again suggesting no impact of HIV-1 infection on the cellular NMD activity. Finally, the expression of endogenous genes with alternative-NMD-targeted splice isoforms was investigated during HIV-1 infection. Even though an impaired degradation of NMD-sensitive splice isoforms was observed for SRS7, this could not be confirmed for hnRNPDL, indicating rather a transcript-specific interference than a global inhibition of the cellular NMD machinery by HIV-1 infection. Der zelluläre nonsense-mediated decay (NMD) pathway erkennt mRNAs mit ungewöhnlichen strukturellen Merkmalen, wie z. B. langen 3'-UTRs oder überlappende Leserahmen und baut diese ab. Viele dieser Merkmale finden sich in viralen Transkripten, was NMD im Licht eines möglichen antiviralen Abwehrmechanismus erscheinen lässt. Diese Arbeit konzentrierte sich auf das Zusammenspiel zwischen dem Humanen Immundefizienz-Virus 1 (HIV-1) und der NMD-Maschinerie. Dies beinhaltete die Analyse von HIV-1 Transkripten und ihrer Empfindlichkeit gegenüber dem NMD vermittelten Abbau, sowie die Analyse der potenziellen infektionsbedingten Modulationen der NMD-Maschinerie. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass HIV-1 Transkripte tatsächlich durch NMD abgebaut werden, insbesondere die mRNAs der 2kb Klasse. Diese NMD-Empfindlichkeit war unabhängig von der Anzahl der Spleißereignisse und damit vermutlich von der Anzahl der Exon-Junction-Komplexe. Weiterhin konnten Transkriptmodifikationen, wie die Verkürzung des 3'-UTRs oder die Wiedereinführung des rev-responsiven Elements (RRE) diese Empfindlichkeit nicht aufheben. Nur das Einfügen des gut bekannten cis-wirksamen Rous-Sarkoma RNA-Stabilitätselements (RSE) in die Sequenz des 3'-UTR, konnte die HIV-1-Transkripte stabilisieren, was die ursprünglich beobachtete NMD-Empfindlichkeit dieser viralen mRNAs bestätigte. Zusätzlich zur beobachteten NMD-Empfindlichkeit von HIV-1 Transkripten wurde die allgemeine Translationsabhängigkeit des NMD-vermittelten mRNA Abbaus untersucht, da einige virale mRNAs mit mutiertem translationalem Startcodon eine Empfindlichkeit gegenüber dem NMD-vermittelten Abbau zeigten. Mit Hilfe eines dualen Luziferase-NMD-Reporters konnte gezeigt werden, dass die intrinsische Stärke des Startcodons nicht nur einen Einfluss auf die Gesamtmenge der mRNA hat, sondern auch die NMD-Empfindlichkeit eines bestimmten Reportertranskripts beeinflusst. Allgemein kann NMD daher weiter als ein von der Translation abhängiger Prozess angesehen werden, aber Transkripte mit NMD-auslösenden Merkmalen könnten der Erkennung und dem Abbau entgehen, indem sie durch ineffiziente Translationsinitiierung niedrige Translationsraten aufrechterhalten. Im Gegensatz zur tat-mRNA könnten daher einige virale Transkripte mit suboptimaler Kozak-Sequenzumgebung, wie HIV-1 rev, vpu und vpr, NMD entgehen. Auf Grundlage der NMD-Sensitivität mancher HIV-1 Transkripte, wurde die mögliche infektionsbedingte Modellierung der NMD Aktivität untersucht, was die die Komplexität von einfach aussehenden NMD-Reportersystemen verdeutlichte. Auf Grundlage alternativer Spleißereignisse konnte gezeigt werden, dass der weit verbreitete Triosephosphat-Isomerase (TPI) NMD Reporter auch bereits ohne vorzeitiges Stoppcodon ein Ziel des NMD-pathways ist. Um die Expression dieser Referenz unabhängig von NMD zu machen, wurde ein zuverlässiges System mit einer einzigen Spleißisoform, durch Modulationen der Spleißstellenstärken geschaffen. Allerdings zeigten weder transiente Transfektionsexperimente mit den modifizierten TPI NMD Reportern, noch lentiviral-transduzierte Zellen, welche das Dual-Luziferase NMD Reportersystem exprimierten, einen Einfluss der HIV-1 Infektion auf die NMD Aktivität. Obwohl bekannt ist, dass Virusinfektionen eine Interferonantwort auslösen können, und die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hindeuten, dass rekombinante Interferone (IFNs) die Aktivität der zellulären NMD-Maschinerie hemmen können, führte eine HIV-1 Infektion weder zu einer verstärkten Expression von Interferon-stimulierten Genen (ISGs) noch zu einer Anhäufung von zellulären NMD-Zielen, was wiederum keinen Einfluss einer HIV-1-Infektion auf die zelluläre NMD Aktivität vermuten lässt. Abschließend wurde die Expression von zellulären Genen mit alternativen Spleißisoformen, von denen manche durch NMD abgebaut werden, während einer HIV-1 Infektion untersucht. Obwohl für SRS7 ein beeinträchtigter Abbau von NMD-empfindlichen Spleißisoformen beobachtet wurde, konnte dies für hnRNPDL nicht bestätigt werden, was eher auf einen transkriptspezifischen Einfluss, als auf eine globale Beeinflussung der zellulären NMD-Maschinerie durch eine HIV-1 Infektion hinweist.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	25.03.2022
Dateien geändert am:	25.03.2022
Promotionsantrag am:	12.10.2021
Datum der Promotion:	11.02.2022