Dokument: Caspase-2 als funktioneller Modulator der p21 WAF1/CIP1 -Expression

Titel:	Caspase-2 als funktioneller Modulator der p21 WAF1/CIP1 -Expression
Weiterer Titel:	Caspase-2 as a functional modulator of p21 WAF1/CIP1 expression
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=58983
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20220314-105944-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Peters, Dominik [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 8,21 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 03.03.2022 / geändert 03.03.2022
Beitragende:	Univ.-Prof. Dr. Sebastian Wesselborg [Gutachter] Prof. Dr. Martin, William F. [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Der CDK -Inhibitor p21 steuert neben der Zellzyklusregulation auch maßgeblich die DNA-Reparatur, die Seneszenz und die Zellalterung und unterliegt deshalb strenger transkriptioneller, posttranskriptioneller und posttranslationaler Regulation. Diesbezüglich wurde die translationale Regulation der p21-Expression durch Caspase-2 erstmals von unserer Arbeitsgruppe beschrieben. Um den Mechanismus dieser translationalen Regulation, für den die p21-3’UTR benötigt wird, näher zu untersuchen, wurden in der vorliegenden Arbeit unter Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems Caspase-2 knockout (KO) Zellen generiert. Diese bestätigten die bisherigen Ergebnisse, die auf Experimenten mit siRNA-vermitteln knockdown von Caspase-2 beruhen. So war die γIR- induzierte p21-Expression in den generierten Caspase-2 KO-Zelllinien 15, 17, 19, 35, 49 und 53, ähnlich wie bei Zellen nach Behandlung mit Caspase-2 siRNA, stark reduziert, wohingegen die Expression in der heterozygoten Caspase-2 KO-Zelllinie 32 nur leicht vermindert war. Im Rahmen der Arbeit konnte gezeigt werden, dass Caspase-2 die p21-Expression nicht selbst über die Bindung der p21-3UTR steuert, da anhand von p21-mRNA-IPs eine direkte Bindung von Caspase-2 an die p21-3’UTR ausgeschlossen werden konnte. Des Weiteren wird auch die Bindung der p21-mRNA-bindenden Proteine (RBPs) hnRNP-K, HuR und AUF1 weder durch die An- noch Abwesenheit von Caspase-2 beeinflusst. Mittels massenspektrometrischer (MS) Analyse von p21-mRNA-IPs wurden zahlreiche Proteine identifiziert, deren Bindung an die p21-3‘UTR bisher noch nicht beschrieben worden war. Eine Caspase-2-abhängige Bindung von TRIM25, Pum2 und PTBP2, die im Rahmen der MS-Analyse als mögliche Kofaktoren für die Caspase-2-abhängige p21-Expression identifiziert wurden, konnte in weiteren Analysen nicht bestätigt werden. Die mRBPs DDX41, PTBP1 und RBM47 binden ebenfalls unabhängig von Caspase-2 spezifisch an die p21-3’UTR und beeinflussen die p21-Expression auf unterschiedliche Weise. Während der knockdown von DDX41 zu einer Erhöhung der basalen oder γIR induzierten p21-Expression führt, wird diese im Gegensatz hierzu in Abwesenheit von RBM47 und PTBP1 reduziert. Dabei hat der knockdown von PTBP1 aber keinerlei Einfluss auf die Transkription oder die Stabilität der p21-mRNA. RBM47 nimmt eine duale Funktion ein, indem es einerseits durch die Induktion der p53-Expression die Transkription der p21-mRNA fördert, aber gleichzeitig diese durch direkte Bindung der p21-3’UTR destabilisiert. Besides its role in cell cycle regulation, the CDK Inhibitor p21 is an important regulator of DNA repair, senescence and cell aging. Hence, p21 is strictly regulated on the transcriptional, post-transcriptional and post-translational level. With regard to this, our laboratory described for the first time the translational regulation of p21 expression by caspase-2. (2) Elucidation of the underlying mechanism which depends on the presence (3) of the p21-3’UTR, was investigated in the present work. Several caspase-2 KO cell lines were successfully generated employing the CRISPR/Cas9-system. Using these clones, the previous results which were based on the siRNA-mediated knockdown of caspase-2 could be confirmed. Similar to cells that have been transfected with the caspase-2 siRNA, γIR-induced p21 expression was significantly reduced in the caspase-2 KO cell lines 15, 17, 19, 35, 49 and 53. In contrast, p21-expression in the heterozygote caspase-2 KO cell line 32 was only slightly decreased. Furthermore, it could be shown that caspase-2 does not control p21 expression by direct binding to the p21-3’UTR, as this could be excluded based on the p21-mRNA-IP results. Furthermore, also binding of the p21-mRNA-binding proteins (RBPs) hnRNP-K, HuR and AUF1 was not affected by the presence or absence of caspase-2. Performing mass spectrometric (MS) analyses, several so far unpublished p21-3’UTR mRBPs were identified. However, the caspase-2 dependent binding of TRIM25, Pum2 und PTBP2 to p21-3’UTR, which had been identified by MS analysis as possible cofactors of the caspase-2-dependent p21 expression, could not be confirmed. The additional identified p21-mRBPs DDX41, PTBP1 and RBM47 bind specifically, but independently of caspase-2 to the p21-3’UTR and regulate p21 expresssion in different manners. Whereas knockdown of DDX41 results in an increase in basal and γIR-induced p21 expression it is reduced in the absence of RBM47 and PTBP1. However, knockdown of PTBP1 has no influence on the transcription or stability of the p21-mRNA, whereas RBM47 seems to regulate p21 in two different ways. On the one hand RBM47 promotes the transcription of the p21-mRNA by inducing p53 expression and on the other hand it destabilizes the p21-mRNA by directly binding to its 3’UTR.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	14.03.2022
Dateien geändert am:	14.03.2022
Promotionsantrag am:	23.11.2021
Datum der Promotion:	18.02.2022