Dokument: CTC Isolation bei Mammakarzinompatientinnen mithilfe von rekombinantem VAR2CSA (rVAR2)

Titel:	CTC Isolation bei Mammakarzinompatientinnen mithilfe von rekombinantem VAR2CSA (rVAR2)
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=58773
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20220218-110534-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Krahn, Caroline [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,86 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 07.02.2022 / geändert 07.02.2022
Beitragende:	Prof. Dr. Neubauer, Hans [Gutachter] Prof. Dr. Stoecklein, Nikolas [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Das Mammakarzinom ist weltweit die mit Abstand häufigste Krebserkrankung bei Frauen. Jährlich sterben bis zu 17.000 Frauen an einem Mammakarzinom in Deutschland. Einer der Gründe ist die extreme Heterogenität des Tumors und das damit verbundene Problem einer gezielten Behandlung. In diesem Kontext könnten in der Zukunft insbesondere zirkulierende Tumorzellen (circulating tumor cells [CTCs]) eine wichtige Rolle zur Erstellung der bestmöglichen Therapie spielen. CTCs können sowohl für die Charakterisierung und die damit verbundene Therapie des Tumors, als auch für die Bestimmung des Schweregrades bzw. des Metastasierungspotentials und als Kontrolle des Ansprechens auf eine Therapie des Mammakarzinoms genutzt werden. Der aktuelle Goldstandard zur Isolation von CTCs ist das CellSearch System (Menarini, Bologna, Italien). Dieses System beruht auf der Anreicherung der CTCs mittels des Oberflächenproteins EpCAM (Epithelial Cellular Adhesion Molecule). Das von Salanti et al. beschriebene Protein VAR2CSA (variant surface antigen 2 chondroitin sulfate A), welches zunächst auf Malaria-infizierten Erythrozyten nachgewiesen wurde, stellt einen neuen Ansatz zur Isolation von CTCs dar. VAR2CSA bindet an Tumorzellen hämatopoetischen, epithelialen und mesenchymalen Ursprungs. Agerbæk et al. beschrieben erstmalig den Einsatz von rekombinantem VAR2CSA (rVAR2) zur Isolation von CTCs: Mittels rVAR2 konnten Tumorzellen von u.a. Leber-, Pankreas- und Lungen-Karzinomen angereichert werden. In Vorarbeiten dieser Dissertation konnte gezeigt werden, dass rVAR2 sowohl an Zelllinien des Mammakarzinoms als auch an CTCs von Patientinnen mit Mammakarzinom bindet. Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit war die Isolation und der Nachweis von CTCs aus dem Blut von Mammakarzinompatientinnen unter Einsatz des rVAR2-Proteins. Nach Isolation epithelialer Zellen mittels rVAR2 wurde deren Abstammung vom Tumor mittels vollständiger Genomamplifikation (Whole Genome Amplification [WGA]) durch Panel-Sequenzierung (Next Generation Sequencing [NGS]) verifiziert und therapierelevante Mutationen nachgewiesen. Nach Lyse der Erythrozyten wurden die Blutproben der Mammakarzinompatientinnen mit dem rVAR2-SpyCatcher Komplex versetzt. Anschließend wurden magnetische Biotin-bindende beads hinzugegeben. Schließlich konnten mit dem KingFisher Instrument (Waltham, MA, USA) die beads-behafteten Tumorzellen mittels magnetischer Kräfte isoliert werden. Nach dem Ablösen der beads konnten die Tumorzellen in Sievewell Multiwell slides für Panzytokeratin, CD45 und DAPI gefärbt werden. Mithilfe des CellCelectors wurden die Proben analysiert und Einzelzellen zur weiteren Charakterisierung isoliert. Das von mir entwickelte Protokoll erlaubt erstmalig eine Aufarbeitung klinischer Blutproben von Mammakarzinompatientinnen. In vier von sechs Patientenproben wurden CTCs isoliert, bei CTCs von zwei dieser Proben wurde stellvertretend mittels WGA und NGS der Nachweis erbracht, dass es sich um Tumorzellen handelte. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass insbesondere triple-negative Brustkrebszelllinien erfolgreicher detektiert werden als luminale Zelllinien. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass es mithilfe des rVAR2-Proteins möglich ist, aus Blut von Mammakarzinompatientinnen CTCs zu isolieren und dies ein vielversprechender Ansatz ist, die Heterogenität von Mammakarzinomen zu erfassen. Breast cancer is the most common cancer in women worldwide. Every year around 17.000 women die due to breast cancer in Germany. One of the reasons is the extreme heterogeneity of the tumor and the associated problem of targeted therapy. In this regard circulating tumor cells (CTCs) might play an important role to enable an individual therapy. CTCs can be used for the characterization of the subtype and the coherent therapy, as well as the determination of the degree of severity or potential for metastasis and to control the response to a breast cancer therapy. The gold standard for isolation of CTCs is the CellSearch system (Menarini, Bologna, Italy). This system is based on the enrichment of CTCs using the surface protein EpCAM (Epithelial Cellular Adhesion Molecule). A new approach could be the protein VAR2CSA (variant surface antigen 2 chondroitin sulfate A), described by Salanti et al., which was found on the surface of malaria-infected erythrocytes and binds to tumor cells of hematopoietic, epithelial and mesenchymal origin. Agerbæk et al. published the use of recombinant VAR2CSA (rVAR2) to isolate CTCs for the first time: They showed that rVAR2 can be used to detect tumor cells of liver, pancreas and lung-carcinoma. In the preliminary work to this dissertation it has been shown that rVAR2 binds to breast cancer cell lines and CTCs from samples of breast cancer patients. The aim of the present study is the detection and isolation of CTCs from breast cancer patients using the rVAR2 protein. After isolation of the CTCs their origin from a tumor was verified by whole genome amplification (WGA) and next generation sequencing (NGS) and therapy-relevant mutations were shown. After blood lysis the rVAR2-SpyCatcher-complex was added to the blood samples of the breast cancer patients. Then magnetic biotin binder beads were added to the sample. Finally, tumor cells attached to the beads were isolated with the KingFisher Instrument (Waltham, MA, USA) by the use of magnetic force. After releasing the beads the tumor cells were transferred into Sievewell multiwell slides for the staining for pan-cytokeratin, CD45 and DAPI. The samples were analyzed with the CellCelector and individual cells were isolated for further characterization. The established protocol allows the processing of clinical patient samples for the first time. CTCs from four out of six patient samples were isolated, in two of these four samples it was demonstrated via WGA and NGS that the isolated cells were tumor cells. In addition, it was found that triple-negative breast cancer cell lines in particular are more successfully detected than luminal cell lines. This dissertation shows that it is possible to isolate CTCs from blood of breast cancer patients using the rVAR2-protein and it is a very promising approach to comprehend the heterogeneity of breast cancer.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	18.02.2022
Dateien geändert am:	18.02.2022
Promotionsantrag am:	29.06.2021
Datum der Promotion:	03.02.2022