Dokument: Strain development of Gluconobacter oxydans and Pseudomonas putida for production of the sweetener 5-ketofructose
| Titel: | Strain development of Gluconobacter oxydans and Pseudomonas putida for production of the sweetener 5-ketofructose | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=58716 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20220228-114152-4 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Wohlers, Karen [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter] Prof. Dr. Martina Pohl [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Consumption of added sugar is a health threat since it can cause obesity and type 2 diabetes. Consequently, there is an increasing demand for sugar substitutes. Available sweeteners, however, have different drawbacks resulting in a need for alternative sugar substitutes. The natural metabolite 5-ketofructose (5-KF) is a promising sweetener candidate. It is not metabolized by the human body and probably not metabolized by the human gut microbiome while having a comparable sweet taste as fructose. 5-KF can be produced from fructose via oxidation by the membrane-bound fructose dehydrogenase (Fdh) of Gluconbacter japonicus, encoded by the fdhSCL genes. Recent studies showed the production of the sweetener with heterologous strains of the industrially relevant acetic acid bacterium Gluconobacter oxydans. As G. oxydans possesses no Fdh, plasmid-based fdhSCL expression was applied in previous studies. For production of a food additive, however, antibiotic-free production is desirable.
Aiming at plasmid- and antibiotic-free 5-KF production, in this study the fdhSCL genes were integrated into the chromosome of engineered G. oxydans IK003.1. Four different genomic integration sites were selected, including three intergenic regions and one gene replacement, to compare the effects of the genomic environment. The four integration strains were successfully constructed, and all allowed functional expression of the fdhSCL genes with minor differences in 5-KF production. However, the efficiency and velocity of 5-KF production was lower compared to plasmid-based fdhSCL expression. To improve the plasmid-free production of the sweetener, the two best integration sites were combined in a double integration strain, G. oxydans IK003.1::fdhSCL² containing two chromosomal fdhSCL copies. This strain showed accelerated 5-KF production, approaching that of the strain with plasmid-based fdhSCL expression. Methods for genetic engineering and expression systems for G. oxydans are still limited. G. oxydans needs complex medium components for good growth and has a low biomass yield. Hence, in the second part of this study, the well-established organism Pseudomonas putida was selected as alternative 5-KF production host. Tn7-based chromosomal integration of the fdhSCL genes enabled P. putida to produce 5-KF from fructose in mineral salts medium. In a batch fermentation with 150 g/L fructose, a product concentration of 129 ± 5 g/L 5-KF was reached. Overall, shake flask experiments, bioreactor cultivations and whole-cell biotransformations demonstrated a competitive ability of P. putida::fdhSCL to produce 5-KF when compared to a G. oxydans fdhSCL integration strain. The substrate spectrum of P. putida::fdhSCL was expanded by plasmid-based expression of inv1417, encoding a periplasmic invertase of G. japonicus. Inv1417 enabled 5-KF production from sucrose as cheaper substrate at rates comparable to production from fructose. All in all, a set of potent G. oxydans and P. putida 5-KF producers was generated in this study, providing a good starting point for further process development and industrial implementation of microbial 5-KF production.Der zunehmende Zuckerkonsum stellt eine große gesundheitliche Bedrohung dar, weil übermäßiger Konsum zu Übergewicht und Typ 2 Diabetes führen kann. Folglich gibt es eine zunehmende Nachfrage nach Zuckerersatzstoffen. Aufgrund verschiedener Nachteile der bereits erhältlichen Süßstoffe gibt es einen Bedarf an alternativen Zuckerersatzstoffen. Der natürliche Metabolit 5-Ketofructose (5-KF) ist ein vielversprechender Süßstoff-Kandidat. 5-KF hat einen ähnlich süßen Geschmack wie Fructose und wird nicht vom menschlichen Körper und vermutlich auch nicht vom Darm-Mikrobiom verstoffwechselt. 5-KF wird durch Oxidation von Fructose mit der membrangebundenen Fructose-Dehydrogenase (Fdh) aus Gluconobacter japonicus, kodiert durch die fdhSCL-Gene, gebildet. Frühere Studien haben sich auf die 5-KF-Produktion mit heterologen Stämmen des industriell relevanten Essigsäurebakteriums Gluconobacter oxydans konzentriert. Da G. oxydans selbst keine Fdh besitzt, wurden die fdhSCL-Gene bisher plasmid-basiert exprimiert. Für die Produktion eines Süßstoffs wäre jedoch eine antibiotika-freie Herstellung wünschenswert. Um eine plasmid- und antibiotika-freie 5-KF-Produktion zu ermöglichen, wurden die fdhSCL-Gene in das Chromosom des optimierten G. oxydans-Stammes IK003.1 integriert. Um den Einfluss der genomischen Umgebung zu testen, wurden vier verschiedene genomische Integrationsorte ausgewählt, drei intergene Regionen und ein Genaustausch. Alle vier Integrationsstämme wurden erfolgreich konstruiert und zeigten nur leichte Unterschiede in der 5-KF Produktion. Allerdings waren die Effizienz und Geschwindigkeit der 5-KF-Bildung geringer als bei den Stämmen mit plasmid-basierter fdhSCL-Expression. Um die plasmid-freie Produktion des Süßstoffs zu steigern, wurde die beiden besten Integrationsorte in einer Doppelintegrante, G. oxydans IK003.1::fdhSCL² mit zwei chromosomalen fdhSCL-Kopien kombiniert. Dieser Stamm zeigte eine beschleunigte 5-KF-Produktion, die nahe an die Rate von Stämmen mit plasmid-basierter fdhSCL-Expression heranreichte. Die Methoden zur genetischen Modifikation sowie die verfügbaren Expressionssystemen für G. oxydans sind noch recht begrenzt. G. oxydans benötigt komplexe Mediums-Bestandteile für gutes Wachstum und erreicht nur eine geringe Biomasse-Ausbeute. Daher wurde das methodisch gut etablierte Bakterium Pseudomonas putida als alternativer Wirt für die 5-KF Produktion ausgewählt. Eine Tn7-basierte chromosomale Integration der fdhSCL-Gene befähigte P. putida zur 5-KF Produktion aus Fructose in Minimalmedium. In einer Batch-Fermentation mit 150 g/L Fructose wurden Produktkonzentrationen von 129 ± 5 g/L 5-KF erreicht. Insgesamt wurde gezeigt, dass P. putida::fdhSCL im Vergleich mit einem G. oxydans fdhSCL-Integrationsstamm vergleichbare Aktivitäten bezüglich der 5-KF-Produktion zeigt und somit ein geeigneter Wirtsorganismus ist. Um statt Fructose das günstigere Substrat Saccharose für die 5-KF-Produktion einsetzen zu können, wurde das Gen inv1417, codierend für eine periplasmatische Invertase aus G. japonicus, in P. putida::fdhSCL plasmid-kodiert exprimiert. Der resultierende Stamm zeigte ausgehend von Saccharose eine 5-KF-Produktionsrate, die vergleichbar war mit der Rate aus Fructose. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit verschiedene G. oxydans und P. putida 5-KF-Produzentenstämme generiert und charakterisiert, die eine gute Grundlage für die weitere Bioprozess-Entwicklung sowie eine industrielle Umsetzung darstellen. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 28.02.2022 | |||||||
| Dateien geändert am: | 28.02.2022 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 26.10.2021 | |||||||
| Datum der Promotion: | 21.01.2022 |
