Dokument: Engineering of Cytochrome P450 Monooxygenases for the Chemo-, Regio-, and Stereoselective Oxidation of Complex Substrates

Titel:	Engineering of Cytochrome P450 Monooxygenases for the Chemo-, Regio-, and Stereoselective Oxidation of Complex Substrates
Weiterer Titel:	Engineering von Cytochrome P450 Monooxygenasen für die chemo-, regio- und stereoselektive Oxidation komplexer Substrate
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=58705
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20220215-111438-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Bokel, Ansgar [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 56,19 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 31.01.2022 / geändert 31.01.2022
Beitragende:	Prof. Dr. Urlacher, Vlada B. [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Karl-Erich Jaeger [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Die selektive Oxidation inerter, nicht-aktivierter Kohlenwasserstoffverbindungen ist eine grundlegende Reaktion bei der Funktionalisierung von organischen Verbindungen. Cytochrom P450 Monooxygenasen (P450 oder CYPs) gehören zu den wenigen Enzymen, die diese anspruchsvolle Reaktion an (zyklischen) Alkanen, Terpenoiden, oder anderen industriell bedeutsamen Verbindungen katalysieren können und stellen somit eine der vielversprechendsten Enzyme im Bereich der Biokatalyse dar. Allerdings findet nur ein Bruchteil aller P450 Anwendung in der industriellen Biokatalyse. Einer der Gründe liegt darin, dass P450 mit nicht-natürlichen Substraten oftmals nur geringe bis moderate Selektivitäten und Aktivitäten zeigen. Mit Beginn der zweiten Welle der Biokatalyse nach Bornscheuer sind eine Vielzahl an Methoden und Strategien im Bereich des Protein Engineerings verfügbar geworden, um Enzyme durch eben diese Steigerung der Selektivität und Aktivität für die industrielle Nutzbarkeit zu optimieren. In dieser Arbeit kamen verschiedene Strategien des Protein Engineerings zum Einsatz, um gezielt die Selektivität und Aktivität der Monooxygenasen CYP154E1 und CYP102A1 (P450 BM3) bei der Oxidation von Ketamine beziehungsweise Cembranoiden zu steigern und deren Anwendung für die Biokatalyse zu demonstrieren. Schwere depressive Störung ist eine ernste und weltweit verbreitete Erkrankung. Dementsprechend hoch ist der Bedarf an wirksamen Antidepressiva. In Kapitel I und II werden CYP154E1 Varianten beschrieben, die durch die Mutagenese von Aminosäuren in der „first-sphere“ des aktiven Zentrums erzeugt wurden und die ausgehend von (S)- und (R)-Ketamin äußerst selektiv in einem Zweistufenprozess die potentiellen Antidepressiva (2S,6S)- (Kapitel I) und (2R,6R)-Hydroxynorketamine (Kapitel II) synthetisieren. Unter der Annahme, dass die Regioselektivität einer P450-katalysierten Reaktion maßgeblich durch die Bindung des Substrates im aktiven Zentrum beeinflusst wird, wird in Kapitel III die Entwicklung eines simulations-unterstützten Arbeitsablaufs zum Design chemo- und regioselektiver P450 BM3 Varianten für die Oxidation des pharmazeutisch interessanten Cembranoids β-Cembrenediol beschrieben. In Kapitel IV wird die Beschreibung der Oxyfunktionalisierung von Cembranoiden durch P450 BM3 fortgeführt. Darin wird sowohl die chemische mit der enzymatischen Synthese, als auch das Substrat- mit dem „first-sphere“ Protein Engineering vereint. Auf diese Weise wurde eine P450 BM3 Variante erzeugt, die 100% Diastereoselektivität bei der Hydroxylierung eines Cembranoid-Derivats zeigte. Zusammenfassend untermauert diese Arbeit die Effektivität der „first-sphere“ Mutagenese zur Selektivitäts- und Aktivitätssteigerung und erweitert die Eignung von P450 Monooxygenasen für die Biokatalyse. The selective oxidation of inert, non-activated hydrocarbon compounds is a fundamental reaction in the functionalization of organic molecules. Cytochrome P450 monooxygenases (P450s or CYPs) belong to the few enzymes which can catalyze this challenging reaction on both cyclic and linear alkanes, terpenoids, or other industrially important compounds and are therefore among the most promising enzymes in the field of biotechnology. However, only a fraction of all P450s finds its application in such an environment. One of the reasons is that P450s often exhibit only low to moderate selectivities and activities with non-natural substrates. Since the beginning of the so-called second wave of biocatalysis according to Bornscheuer, various protein engineering methods and strategies have become available to optimize enzymes for industrial utility, including increasing their selectivity and activity. In this thesis, various protein engineering strategies were employed to specifically enhance the selectivity and activity of the two monooxygenases CYP154E1 and CYP102A1 (P450 BM3) in the oxidation of ketamine and cembranoids, respectively, and to demonstrate their application in biocatalysis. Major depressive disorder is a severe and globally prevalent mental disorder, and the need for effective antidepressants is accordingly high. Chapter I and II describe the construction of two CYP154E1 variants by using first-sphere active site mutagenesis. These variants enable the highly chemo-, regio- and stereoselective two-step oxidation either of (S)- or (R)-ketamine, yielding the potential antidepressants (2S,6S) (Chapter I), and (2R,6R)-hydroxynorketamine (Chapter II). Assuming that the regioselectivity of a P450-catalyzed reaction is significantly influenced by the binding of the substrate in the active site, a simulation-based workflow was developed and applied for the design of P450 BM3 variants for the chemo- and regioselective oxidation of the pharmaceutically interesting cembranoid β-cembrenediol as examples, as described in Chapter III. Chapter IV describes an approach combining substrate engineering of various cembranoid compounds with first-sphere active site mutagenesis of P450 BM3 to achieve highly selective hydroxylation. The result was a P450 BM3 variant with absolute diastereoselectivity in the hydroxylation of a cembranoid derivative. In summary, this thesis demonstrates the effectiveness of the first-sphere mutagenesis for selectivity and activity enhancement and extends the suitability of P450 monooxygenases for biocatalysis.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	15.02.2022
Dateien geändert am:	15.02.2022
Promotionsantrag am:	25.06.2021
Datum der Promotion:	22.11.2021