Dokument: Structure-function studies and drug discovery targeting penicillin binding protein 3 from Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa

Titel:	Structure-function studies and drug discovery targeting penicillin binding protein 3 from Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=58682
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20220131-111229-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Freischem, Stefan [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 10,29 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 27.01.2022 / geändert 27.01.2022
Beitragende:	apl. Prof. Dr. Dingley, Andrew J. [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	The lack of antibiotics against multidrug resistant (MDR) bacteria is one of the major challenges of medicine in the 21st century. In particular, Gram-negative bacteria, such as Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) and Escherichia coli (E. coli), are responsible for thousands of deaths every year. Identifying new classes of antibiotics that are active against MDR bacteria is vital to combat against the growing number of bacteria that have developed and adapted mechanisms against current antibiotics. In this thesis, a fragment-based drug discovery (FBDD) approach targeting the penicillin binding protein 3 (PBP3) was performed using 19F nuclear magnetic resonance (NMR) as a screening method to identify small molecules, termed fragments, binding PBP3. Seventeen hit fragments were identified from the two screens conducted and may be used in subsequent chemistry approaches, e.g., linking and merging, to synthesize a drug with high (i.e., < nM) affinity toward PBP3 with inhibitory activity. To analyze the identified hit fragments and validate their interaction with PBP3, two-dimensional (2D) heteronuclear NMR experiments of PBP3 were recorded to perform a chemical shift perturbation analysis, revealing a common binding site close to the active site for four hit fragments. Competition binding using the novel β-lactam antibiotic AIC499, which covalently binds the active site, was used to gain further insights into the binding mode of the fragments. Interestingly, binding of two fragments was found to be enhanced by bound AIC499. Furthermore, in a 19F NMR titration experiment, the Kd value of one of the hit fragments was estimated to be 1.23 ± 0.54 mM, which is in the expected affinity range for FBDD. In addition to the FBDD approach targeting PBP3 from E. coli, AIC499 that is active in the presence of β-lactamases was co-crystallized with PBP3s from E. coli and P. aeruginosa and the binding mode was analyzed. Moreover, the apo proteins were crystallized and the structures of apo PBP3 from P. aeruginosa provided novel insights into the β3-β4 loop, which is a hotspot for various mutations related to antibiotic resistance. Additionally, a novel extended construct (termed EcTPd*) featuring the catalytic transpeptidase domain (TPd) from E. coli PBP3 was produced and crystallized in the apo form and in the presence of AIC499, yielding samples with improved diffraction quality. In a parallel effort to develop a new class of antibiotics, pyrrolidine-2,3-dione derivatives were developed in high-throughput screening (HTS) and their binding to PBP3 was analyzed by surface plasmon resonance (SPR), NMR and fluorescence spectroscopy. The results from these experiments validated the interaction of these derivatives with PBP3 from P. aeruginosa and Kd values were determined. In summary, fragments, found in the FBDD approach and the novel AIC499 and pyrrolidine-2,3-dione derivatives, investigated in this thesis, represent promising candidates in future development of new classes of antibiotics. Furthermore, it was possible to gain additional information on the structure of PBP3s and sequence-specifically assign approximately 40% of the peaks in the 2D 1H-15N transverse relaxation-optimized spectroscopy heteronuclear single quantum coherence (TROSY-HSQC) spectrum of EcTPd*. These results may be crucial requirements when future antibiotic development targeting PBP3 is conducted. Der Mangel an Antibiotika, welche gegen multiresistente (MDR) Bakterien wirksam sind, ist eine der größten Herausforderungen der medizinischen Forschung im 21. Jahrhundert. Vor allem Gram-negative Bakterien, wie Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) und Escherichia coli (E. coli) sind verantwortlich für jährlich Tausende Tote. Aufgrund ihrer Fähigkeit Mechanismen gegen neue Antibiotika zu entwickeln und anzupassen, ist es unumgänglich neue Antibiotikaklassen gegen MDR Keime zu entwickeln. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe von 19F-kernmagnetischer Resonanz (NMR)-Spektroskopie als Selektionsmethode eine Fragment-basierte Medikamenten-Entwicklung (FBDD) gegen das Penicillin-bindende Protein 3 (PBP3) durchgeführt, um kleine, das Protein bindende Moleküle zu identifizieren (sogenannte Fragmente). Dabei wurden in zwei Runden siebzehn Fragmente identifiziert, bei denen eine initiale Bindung gegen PBP3 nachgewiesen werden konnte. Diese können in der weiteren Entwicklung zum Vergrößern („growing“), Verknüpfen („linking“), oder Verschmelzen („merging“) genutzt werden um größerer Moleküle zu generieren, die höhere Affinitäten (< nM) gegen das Zielprotein aufweisen und dessen Aktivität inhibieren. Zur Validierung und Analyse der Interaktion von identifizierten Fragmenten mit dem Zielprotein wurden zweidimensionale (2D) NMR-Experiment für eine Analyse der Änderungen der chemischen Verschiebung aufgenommen. Dabei wurden vier Fragmente gefunden, die das PBP3 in der Nähe des aktiven Zentrums binden. In einer kompetitiven Bindungsstudie mit dem neu entwickelten β-Lactam-Antibiotikum AIC499, welches kovalent im aktiven Zentrum bindet, wurden zusätzliche Informationen über den Bindungsmodus der Fragmente erhoben. Interessanterweise wurde die Bindung zweier Fragmente durch das kovalent gebundene AIC499 verstärkt. Des Weiteren wurde mit Hilfe von 19F NMR-Experimenten der Kd-Wert eines Fragments auf 1.23 ± 0.54 mM bestimmt, was im zu erwarteten Affinitätsbereich bei der Bindung von Fragmenten liegt. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit das neu entwickelte β-Lactam-Antibiotikum AIC499, welches sogar in Anwesenheit von β-Lactamasen antimikrobielle Aktivität zeigt, mit den PBP3s von E. coli und P. aeruginosa co-kristallisiert, um den Bindemechanismus zu analysieren. Im Zuge dessen wurden die apo-Proteine kristallisiert und neue Einblicke in die β3-β4-Schleife des P.-aeruginosa-PBP3 gewonnen, welche im Zusammenhang mit mehreren Mutationen von Antibiotika-resistenten PBP3s steht. Zusätzlich wurde ein neues Konstrukt der katalytischen Transpeptidasedomäne (TPd) des E.-coli-PBP3 produziert und kristallisiert (EcTPd*), so dass EcTPd*-Kristalle mit und ohne AIC499 eine verbesserte Diffraktionsqualität ergaben. In weiteren Bemühungen eine neue Antibiotikaklasse zu entwickeln, wurden Pyrrolidin-2,3-dion-Derivate in einem Hochdurchsatz-Screening (HTS) entwickelt und die Interaktion mit PBP3 analysiert. Dazu wurden die biophysikalischen Methoden der Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR)-, NMR- und Fluoreszenz-Spektroskopie genutzt, die P.-aeruginosa-PBP3-Binding validiert und Kd-Werte ermittelt. Letztendlich können die Fragmente, die in dem FBDD-Ansatz gefunden wurden, AIC499 und die Pyrrolidin-2,3-dion-Derivate als vielversprechende Kandidaten in der zukünftigen Antibiotika-Entwicklung betrachtet werden. Außerdem wurden neue strukturelle Daten generiert und ungefähr 40% der Peaks in einem 2D 1H-15N Transversalrelaxation-optimierter Spektroskopie heteronukleare Einzelquantenkohärenz (TROSY-HSQC) -Spektrum der EcTPd*-Probe sequenz-spezifisch zugeordnet. Diese Ergebnisse könnten für die zukünftige Antibiotika-Entwicklung gegen PBP3 eine wichtige Voraussetzung darstellen.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	31.01.2022
Dateien geändert am:	31.01.2022
Promotionsantrag am:	18.11.2021
Datum der Promotion:	25.01.2022