Dokument: Verlässliche massenspektrometrische Techniken für neue Einblicke in das Kallikrein-Kinin-System - moderne bioanalytische Peptidquantifizierung einer endogenen Kaskade
| Titel: | Verlässliche massenspektrometrische Techniken für neue Einblicke in das Kallikrein-Kinin-System - moderne bioanalytische Peptidquantifizierung einer endogenen Kaskade | |||||||
| Weiterer Titel: | Reliable mass spectrometric techniques for new insights into the kallikrein-kinin system – modern bioanalytical peptide quantitation of an endogenous cascade | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=58559 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20220118-111340-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Gangnus, Tanja [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Uni.-Prof. Läer Stephanie [Gutachter] Prof. Dr. Kojda, Georg [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | kallikrein-kinin system, bradykinin, LC-MS, COVID-19, contact activation | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Dem Kallikrein-Kinin System (KKS) wird eine zentrale Rolle bei zahlreichen Erkrankungen zugeschrieben. Dies wurde jüngst im Rahmen der Pandemie COVID-19 untermauert, bei der früh ein Bradykinin-Sturm ursächlich für die Pathologie postuliert wurde. Somit ist ein besseres Verständnis der (patho)physiologischen Bedeutung des KKS essentiell, um die Rationale für die Entwicklung neuer therapeutischer Angriffspunkte innerhalb des KKS zu schaffen. Aufgrund des Mangels verlässlicher bioanalytischer Assays für Kininpeptide sollten im Rahmen dieser Arbeit umfassende und regulatorisch konforme bioanalytische Plattformen auf Basis der Massenspektroskopie erarbeitet und klinisch angewendet werden.
Im Vordergrund der Arbeit stand die Etablierung bioanalytischer massenspektrometrischer Plattformen für die simultane und verlässliche Quantifizierung der Kininpeptide Bradykinin, Kallidin, Des-Arg(9)-bradykinin, Des-Arg(10)-kallidin, Bradykinin 1-7, Bradykinin 2-9 und Bradykinin 1-5 in Plasma und respiratorischen Lavageflüssigkeiten. Die bekannten Limitationen der bisher häufig angewandten Immunoassays durch Kreuzreaktionen wurden durch den Einsatz von hocheffizienten und orthogonalen Trennungstechniken überwunden. Die Erfassung der niedrigen endogenen Peptidspiegel wurde erfolgreich durch eine Optimierung der Ionisationseffizienz und Reduktion der unspezifischen Peptidadsorption mittels statistischer Versuchsplanung ermöglicht. Der umfassenden Methodenentwicklung schloss sich eine Validierung der Assays entsprechend internationaler bioanalytischer Leitlinien aus 150 µl Plasma und 100 µl respiratorischer Lavageflüssigkeiten mit sensitiven Quantifizierungsgrenzen von bis zu 2 pg/mL für die Kininpeptide an. Aufbauend widmete sich diese Arbeit auch der systematischen Untersuchung präanalytischer Variablen, die wiederum für bis zu ¾ aller Quantifizierungsfehler in der Bioanalytik verantwortlich sein können. Durch die Identifizierung bedeutender Einflussfaktoren auf artifizielle Veränderungen von Plasmakininspiegeln während der Blutabnahme und aufbereitung konnte ein standardisiertes präanalytisches Protokoll entwickelt werden. In einer proof-of-concept Untersuchung war die Anwendung des Protokolls in Kombination mit der bioanalytischen Plattform durch Detektion niedriger endogener Kininlevel (<5 pg/mL) mit geringer interindividueller und Inter-Tagesvariabilität charakterisiert. Die entwickelten massenspektrometrischen Plattformen wurden abschließend in klinischen Studien angewendet. Umfassende Kininprofile wurden in 28 gesunden Erwachsenen erhoben, um verlässliche Daten für Kontrollgruppen zu erheben. Darüber hinaus konnte zusammen mit internationalen Forschungsteams aus Leuven und Nijmegen in klinischen Studien mit COVID-19 Patienten erstmalig gezeigt werden, dass das KKS wesentlich an der Pathologie von COVID-19 beteiligt ist. Der umgehende Einsatz der entwickelten Methoden lieferte einen wertvollen Beitrag auf dem aktuell gesellschaftlich hochrelevanten Feld der Corona-Forschung.The kallikrein-kinin system (KKS) is considered to play a central role in numerous diseases. This was recently underscored in the context of the COVID-19 pandemic, in which a bradykinin storm was postulated early to be causative for the disease pathology. Thus, a better understanding of the (patho)physiological significance of the KKS is essential to provide the rationale for the development of new therapeutic targets within the KKS. Due to the lack of reliable bioanalytical assays for kinin peptides, comprehensive and guideline compliant bioanalytical platforms based on mass spectroscopy were intended to be developed and clinically applied within the scope of this thesis. The focus of the work was the establishment of bioanalytical mass spectrometric platforms for the simultaneous and reliable quantification of the kinins bradykinin, kallidin, des-Arg(9)-bradykinin, des-Arg(10)-kallidin, bradykinin 1-7, bradykinin 2-9 and bradykinin 1-5 in plasma and respiratory lavage fluids. The known limitations of previously commonly used immunoassays by cross-reaction have been overcome by the use of highly efficient and orthogonal separation techniques. The detection of low endogenous peptide levels was successfully enabled by optimising ionisation efficiency (factor of 7.7) and reducing non-specific peptide adsorption (factor of 26.6) using design of experiments. The comprehensive method development was followed by validation of the assays according to international bioanalytical guidelines applying 150 µL of plasma and 100 µL of respiratory lavage fluids with sensitive quantification limits of down to 2 pg/mL for the kinin peptides. Based on this, this work was also dedicated to the systematic investigation of pre-analytical variables, which in turn can be responsible for up to ¾ of all quantification errors in bioanalysis. By identifying significant factors causing artificial changes in plasma kinin levels during blood collection and processing, a standardised pre-analytical protocol was developed. In a proof-of-concept study, the application of the protocol in combination with the bioanalytical platform was characterised by detection of low endogenous kinin levels (<5 pg/mL) with limited inter-individual and inter-day variability. The developed mass spectrometric platforms were finally applied within clinical studies. Comprehensive kinin profiles were collected in 28 healthy adults to provide reliable data for control groups. In addition, in cooperation with international research teams from Leuven and Nijmegen, clinical studies with COVID-19 patients demonstrated for the first time that the KKS is significantly involved in the pathology of COVID-19. The prompt application of the developed methods provided a valuable contribution to the currently socially highly relevant field of corona research. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Klinische Pharmazie und Pharmakotherapie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 18.01.2022 | |||||||
| Dateien geändert am: | 18.01.2022 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 10.06.2021 | |||||||
| Datum der Promotion: | 02.12.2021 |
