Dokument: Überprüfung der Interaktion des Uhrenproteins PER2 mit dem Protein GAPVD1 durch Proximity Ligation Assay
| Titel: | Überprüfung der Interaktion des Uhrenproteins PER2 mit dem Protein GAPVD1 durch Proximity Ligation Assay | |||||||
| Weiterer Titel: | Verification of the Interaction between the Clock Protein PER2 and GAPVD1 by Proximity Ligation Assay | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=58507 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20220111-132956-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Mundorf, Anna Katharina [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Reinke, Hans [Gutachter] PD Dr. rer. nat. Stork, Björn [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | circadiane Uhr, PER2, GAPVD1, Proximity Ligation Assay | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Circadiane Rhythmik entsteht durch zellautonome biologische Uhren, die in so gut wie allen lichtsensitiven Organismen vorhanden sind. Circadiane Uhren in Säugetieren sind hierarchisch organisiert. Ein zentraler Schrittmacher im Nucleus suprachiasmaticus des Hypothalamus wird über die Augen durch Licht mit der Umwelt synchronisiert. Der zentrale Schrittmacher synchronisiert seinerseits zelluläre Uhren in fast allen anderen Körperzellen durch neuronale, endokrine und metabolische Mechanismen. Der zugrunde liegende molekulare Mechanismus beruht auf Uhrengenen, die durch negative Rückkopplungsschleifen miteinander verbunden sind und dadurch ihre eigene rhythmische Expression antreiben. Den Kern des molekularen Oszillators bilden die Aktivatorproteine CLOCK und BMAL1 zusammen mit den Per- und Cry-Repressorgenen. Die zentrale negative Rückkopplungsschleife durchläuft innerhalb von 24 h einmal den folgenden Zyklus: CLOCK und BMAL1 bilden Heterodimere und aktivieren die Transkription der Gene Per1/2 und Cry1/2. Mit steigender Konzentration der Proteine PER1/2 und CRY1/2 im Zytoplasma bilden sich PER-und CRY-enthaltende Proteinkomplexe, die in den Kern transportiert werden und dort durch Bindung an die CLOCK-BMAL1-Heterodimere ihre eigene Expression reprimieren.
In Vorarbeiten wurde gefunden, dass das Uhrengen Per2 eine zentrale Rolle bei der circadianen Regulation der Autophagie spielt, und dass PER2 mit GAPVD1, einem Regulator kleiner G-Proteine, assoziiert ist. Da GAPVD1 vesikulären Transport und Autophagie reguliert, könnte dieses Protein ein Schnittpunkt zwischen der circadianen Uhr und diesen Prozessen sein. Ziel dieser Arbeit war die Bestätigung der Interaktion von PER2 und GAPVD1 durch eine unabhängige Methode sowie die intrazelluläre Lokalisierung der GAPVD1-PER2-Interaktionen. Mittels Immunfluoreszenzfärbung und RNA-Interferenz wurden unterschiedliche Antikörper gegen PER2 oder GAPVD1 auf ihre Bindungsaffinität sowie ihre Spezifität hin untersucht. Geeignete Antikörper wurden anschließend im Proximity Ligation Assay (PLA) genutzt. Bei dieser Methode entstehen bei extrem enger Colokalisierung zweier Proteine mikroskopisch nachweisbare Fluoreszenzsignale. Durch den PLA konnte die Interaktion der Proteine PER2 und GAPVD1 bestätigt werden. Zudem weisen die Ergebnisse darauf hin, dass die Interaktionen von PER2 und GAPVD1 so gut wie ausschließlich im Zytoplasma stattfinden.Circadian Rhythms are generated by cell-autonomous biological clocks, which exist in basically all light sensitive organisms. Circadian clocks in mammals are organized hierarchically. A central pacemaker located in the suprachiasmatic nucleus in the hypothalamus is synchronized by environmental light that falls on the retina. The central pacemaker synchronizes cellular clocks in almost all body cells by neuronal, endocrine, and metabolic mechanisms. The underlying molecular mechanism is based on clock genes, which are connected through negative feedback loops and thereby drive their own rhythmic expression. The core of the circadian clock consists of the activator proteins CLOCK and BMAL1 together with the Per- and Cry- repressor genes. Within 24 hours this central negative feedback loop completes one time the following cycle: Heterodimers of CLOCK and BMAL1 stimulate the transcription of the genes Per1/2 and Cry1/2. With rising concentrations of PER1/2 and CRY1/2 in the cytoplasm, PER-and CRY-containing complexes are formed. These complexes are transported to the nucleus where they repress their own expression through binding to CLOCK-BMAL1-heterodimers. Preliminary studies showed that the clock gene Per2 plays a central role for the circadian regulation of autophagy. Furthermore, they demonstrated that PER2 is associated with GAPVD1, a regulator of small G-proteins. Since GAPVD1 regulates vesicular transport and autophagy, this protein could act at the intersection between the circadian clock and these processes. The aim of this work was to confirm the interaction between PER2 and GAPVD1 by an independent method and to localize the GAPVD1-PER2-interactions within the cell. Various antibodies against PER2 and GAPVD1 were tested by immunostaining and RNA-interference for their binding affinity and specificity. Suitable antibodies were then used for the Proximity Ligation Assay (PLA). This method produces microscopically detectable fluorescent signals when two proteins are extremely closely colocalized. Interaction of PER2 and GAPVD1 was confirmed by PLA. Furthermore, the results indicate that PER2 and GAPVD1 interact almost exclusively in the cytoplasm. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 11.01.2022 | |||||||
| Dateien geändert am: | 11.01.2022 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 09.04.2021 | |||||||
| Datum der Promotion: | 02.12.2021 |
