Dokument: Optogenetic control of bio(techno)logical processes in bacteria at different cellular levels

Titel:	Optogenetic control of bio(techno)logical processes in bacteria at different cellular levels
Weiterer Titel:	Optogenetische Kontrolle von bio(techno)logischen Prozessen in Bakterien auf unterschiedlichen zellulären Ebenen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=58341
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20211220-081716-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hilgers, Fabienne [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 192,80 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.12.2021 / geändert 13.12.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Pietruszka, Jörg [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In the field of synthetic biology, both the strict and straightforward orchestration as well as a simple and robust visualization of biological processes is indispensable. The environmental factor light seems to be ideally suited for this task, as it represents a very precise, spatially, and temporally highly tunable and flexible stimulus. Thus, this thesis aimed to establish optogenetic strategies for controlling versatile biological processes on different cellular levels. On the transcriptional level, novel variants of the light-responsive inducer molecule caged IPTG were successfully applied for light-inducible gene expression in several expression hosts including E. coli, P. putida and B. subtilis. Those photocaged inducer variants strongly differ either in their water-solubility or exhibit bathochromatically shifted absorption maxima. This optogenetic principle was further transferred to the phototrophic production host R. capsulatus by adapting the illumination conditions allowing for both phototrophic growth and optogenetic control. Additionally, photocaged benzoate derivatives and corresponding regulator/promoter systems, which had not yet been applied for light-mediated gene expression, were utilized for multichromatic orchestration of target gene expression in P. putida. To implement light control at the posttranslational and cellular level, fluorescent proteins were characterized for their suitability as genetically encoded photosensitizers. It could be demonstrated that some fluorescent proteins generate high amounts of different reactive oxygen species thereby allowing to control enzyme activity as well as cell viability of various Gram-positive and Gram-negative bacteria as well as cancer cells. Further, metabolic pathways, such as the biosynthesis of plant terpenes, were established in R. capsulatus and optogenetic modulation of precursor accumulation could subsequently be demonstrated in case of carotenoid biosynthesis as a proof of concept. Finally, new optogenetic toolbox was applied to control and visualize intercellular processes, such as the horizontal gene transfer, at the single cell level. Conclusively, versatile light-responsive tools for controlling biological functions on various cellular levels were established in E. coli, transferred to alternative expression hosts such as P. putida, B. subtilis or R. capsulatus and finally applied in first biotechnological applications. These results thus clearly demonstrate a broad applicability of both the novel photocaged inducers and the genetically encoded photosensitizers as versatile optogenetic control systems for biotechnological and biomedical applications. Therefore, the established optogenetic on- and off-switches are promising candidates for the light-dependent, dynamic control of metabolic, regulatory and intercellular communication processes. Im Bereich der synthetischen Biologie ist die strikte Kontrolle und direkte Ansteuerung biologischer Prozesse sowie deren einfache und robuste Visualisierung von entscheidender Bedeutung. Der Umweltfaktor Licht ist als Stimulus hierfür hervorragend geeignet, da er sehr präzise und flexibel ist sowie mit einer hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung eingesetzt werden kann. Daher hat die vorliegende Arbeit zum Ziel, geeignete optogenetischen Strategien zur Kontrolle von vielseitigen biologischen Prozessen auf unterschiedlichen Zellebenen zu etablieren. Auf der Ebene der Gen-Transkription wurden neue Varianten des Licht-sensitiven Induktormoleküls photocaged IPTG eingesetzt. So konnte erfolgreich eine Lichtinduzierbaren Genexpression in verschiedenen Wirtsorganismen, wie E. coli, P. putida und B. subtilis, implementiert werden. Diese photocaged compound-Varianten unterscheiden sich deutlich in ihrer Wasserlöslichkeit oder weisen rotverschobene Absorptionsmaxima auf. Um diese optogenetische Strategie auf den phototrophen Produktionsstamm R. capsulatus übertragen zu können, wurden dessen Beleuchtungsbedingungen so angepasst, dass sie sowohl phototrophes Wachstum mit infrarotem Licht, als auch optogenetische Kontrolle mit sichtbarem Licht ermöglichen. Zusätzlich konnten erstmals photocaged Benzoat-Derivate und entsprechende Regulator/Promotor-System zur Licht-gesteuerten Genexpression in P. putida eingesetzt werden. Um eine Licht-basierten Kontrolle biologischer Prozesse auf post-translationaler Ebene und auf zellulärer ebene zu ermöglichen, wurden verschiedene Fluoreszenzproteine im Hinblick auf ihre Funktion als genetisch kodierte Photosensibilisatoren charakterisiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass bestimmte Fluoreszenzproteine große Mengen unterschiedlicher reaktiver Sauerstoffspezien produzieren, welche zur Kontrolle von Enzymaktivitäten sowie zur Beeinflussung der Zellviabilität verschiedener Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien und sogar von Tumorzellen genutzt werden konnten. Außerdem wurden verschiedene Stoffwechselwege wie etwa die Biosynthese von pflanzlichen Terpenen in R. capsulatus implementiert und am Beispiel der Carotenoid-Synthese gezeigt, dass die Akkumulierung von Vorstufenmolekülen optogenetisch moduliert werden kann. Zusätzlich konnte die Optogenetik auf Einzelzellebene zur Visualisierung und Kontrolle interzellulärer Prozesse wie dem horizontalen Gentransfer eingesetzt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden somit vielfältige Licht-sensitive Kontrollmechanismen biologischer Funktionen auf unterschiedlichen Zellebenen in E. coli etabliert, auf die alternativen Expressionswirte P. putida, B. subtilis und R. capsulatus übertragen und anschließend in ersten biotechnologischen Anwendungen erprobt. Dabei zeigten die Ergebnisse eine breite Anwendbarkeit der neuen photocaged inducers und der genetisch kodierten Photosensibilisatoren als optogenetische Kontrollsysteme für die Biotechnologie und Biomedizin auf. Folglich stellen die hier etablierten optogenetischen An- und Aus-Schalter vielversprechende Kandidaten für den Einsatz zur Lichtabhängigen und dynamischen Kontrolle von Stoffwechselwegen, Regulationsmechanismen und interzellulären Kommunikationsprozessen dar.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	20.12.2021
Dateien geändert am:	20.12.2021
Promotionsantrag am:	10.06.2021
Datum der Promotion:	02.12.2021