Dokument: Influence of mutations at the type 1 copper site of a two-domain laccase: Biochemical and biophysical characterization

Titel:	Influence of mutations at the type 1 copper site of a two-domain laccase: Biochemical and biophysical characterization
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=58307
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20211214-133257-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Olbrich, Anna Caroline [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 12,43 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 10.12.2021 / geändert 10.12.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Urlacher, Vlada B. [Gutachter] Jun.-Prof. Dr. Span, Ingrid [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Laccases (EC 1.10.3.2) belong to the multicopper oxidase family and represent promising biocatalysts for various applications due to their ability to oxidize phenols, aryl amines, anilines, benzenethiols, and inorganic metal ions. They couple four one-electron oxidations of a substrate to the four-electron reduction of dioxygen to water which is the only by-product of the laccase catalyzed reaction. The active site of laccases contains four copper ions. The primary electron acceptor in laccases is a type 1 (T1) Cu and electrons are transferred through the protein over a distance of 13 Å to the trinuclear copper cluster (TNC), where dioxygen reduction occurs. In contrast to fungal laccases, bacterial laccases are often active at alkaline pH, and stable at elevated temperatures and in the presence of organic solvents but possess lower activities. The reduction potential E° of the T1 Cu is assumed to correlate with enzyme activity and therefore is a target of protein engineering efforts that increase E° and thereby the activity and substrate spectrum in bacterial laccases. As bacterial two-domain laccases have been discovered more recently they remain less investigated compared to well-studied three-domain laccases. To identify molecular factors influencing the T1 Cu E° in the two-domain laccase Ssl1 from Streptomyces sviceus, a set of enzyme variants with mutated T1 Cu axial ligand was constructed and characterized. The hydrophobicity of the T1 Cu axial ligand was found to provide the major contribution to the reduction potential changes in the mutants. The highest E° was measured with the M295I mutant (467 mV compared to 375 mV in the wild-type), the lowest for M295A and M295T (<290 mV). Through additional mutations in the second coordination sphere of the T1 Cu E° increased up to 560 mV. A good correlation between E° and laccase activity was observed for substituted phenols. Additionally, Ssl1 variants with E°≥500 mV were able to oxidize 4-methylphenol, 2-tert-butylphenol and 4-tert-butylphenol, which were not converted by the wildtype enzyme (375 mV), thus extending the substrate spectrum. However, there was no obvious correlation between E° and kinetic parameters for the oxidation of the low redox-potential syringaldazine. For the oxidation of two large dyes, alizarin red S and indigo carmine, a correlation was only observed for Ssl1 variants with E°>470 mV. These observations and further measurements of the T1 Cu reduction kinetics indicated that replacing the axial ligand methionine impacts all three factors that determine electron transfer rates: reduction potential, reorganization energy, and electronic coupling between the substrate and the T1 Cu. Due to the large influence of the axial ligand, the structural and spectroscopic properties of the T1 Cu site of Ssl1 variants with various axial ligands were investigated. The Ssl1 variants M295A/V/I/Y/F/T displayed perturbed spectral features like those observed in four-coordinate T1 Cu sites with an axial oxygen ligand, e.g., a water molecule. The presence of a water ligand was confirmed in the crystal structures of the Ssl1 variants M295A/V/I/Y/F. The accompanying tetrahedral distortion of the coordination geometry suggests that the reorganization energy for the CuII/CuI reduction increased. To study the intramolecular electron transfer in Ssl1 a ruthenated variant with a [Ru(bipyridine)2(imidazole)] complex bound close to the T1 Cu site was synthesized. Site-specific ruthenation required a single surface-exposed histidine accessible for the reaction and a Ssl1 H85Q/H132Q/ΔC mutant was created for this purpose. Formation of the Ssl1-ruthenium complex was verified by fluorescence spectroscopy. Measurements of the intramolecular electron transfer were complicated by short fluorescence lifetimes that were observed for the ruthenated Ssl1 sample and other approaches for intramolecular electron transfer measurements were proposed. Laccasen (EC 1.10.3.2) gehören zur Familie der Multikupferoxidasen und sind vielversprechende Biokatalysatoren für verschiedene Anwendungen aufgrund ihrer Fähigkeit, Phenole, Arylamine, Aniline, Thiophenole und anorganische Metallionen zu oxidieren. Sie koppeln vier Ein-Elektronen-Oxidationen eines Substrats an die Vier-Elektronen-Reduktion von Sauerstoff zu Wasser, welches das einzige Nebenprodukt der Laccase-Reaktion ist. Das aktive Zentrum von Laccasen enthält vier Kupferionen. Der primäre Elektronenakzeptor in Laccasen ist ein Typ 1 (T1) Cu und die Elektronen werden über eine Entfernung von ~13 Å durch das Protein zum dreikernigen Kupfercluster (TNC) übertragen, wo die Reduktion von Sauerstoff stattfindet. Im Gegensatz zu pilzlichen Laccasen sind bakterielle Laccasen oft bei alkalischem pH aktiv sowie stabil bei erhöhten Temperaturen und in Gegenwart von organischen Lösungsmitteln, besitzen aber geringere Aktivitäten. Es wird angenommen, dass das Reduktionspotential E° des T1 Cu mit der Enzymaktivität korreliert. Es ist daher ein Ziel von Proteinengineering, E° und damit die Aktivität und das Substratspektrum von bakteriellen Laccase zu erhöhen. Da bakterielle Zwei-Domänen-Laccasen erst in jüngerer Zeit entdeckt wurden, sind sie im Vergleich zu Drei-Domänen-Laccasen noch viel weniger untersucht. Um molekulare Faktoren zu identifizieren, die das T1 Cu E° in Zwei-Domänen-Laccasen beeinflussen, wurden Mutanten der kleinen Zwei-Domänen-Laccase Ssl1 aus Streptomyces sviceus konstruiert und charakterisiert. Es wurde festgestellt, dass die Hydrophobizität des axialen T1-Cu-Liganden, M295 in Wildtyp-Ssl1, den Hauptbeitrag zu den Veränderungen des Reduktionspotentials in den axialen Ligandenmutanten darstellt. Das höchste E° wurde für die M295I-Mutante gemessen (467 mV im Vergleich zu 375 mV im WT), das niedrigste für M295A und M295T (<290 mV). Durch zusätzliche Mutationen in der zweiten Koordinationssphäre des T1 Cu stieg E° auf bis zu 560 mV. Eine gute Korrelation zwischen E° und Laccaseaktivität wurde für substituierte Phenole beobachtet. Zusätzlich waren Ssl1-Varianten mit E°≥500 mV in der Lage, 4-Methylphenol, 2-tert-Butylphenol und 4-tert-Butylphenol zu oxidieren, die vom Wildtyp-Enzym (375 mV) nicht umgesetzt wurden, wodurch das Substratspektrum erweitert wurde. Für die Oxidation von Syringaldazin gab es keine offensichtliche Korrelation zwischen E° und den kinetischen Parametern. Für die Oxidation von zwei Farbstoffen, Alizarinrot S und Indigokarmin, wurde eine Korrelation nur für Ssl1-Varianten mit E° >470 mV beobachtet. Diese Beobachtungen und weitere Messungen der Kinetik der T1 Cu-Reduktion deuteten darauf hin, dass der Austausch des axialen Liganden Methionin alle drei Faktoren beeinflusst, die die Elektronentransferraten bestimmen: Reduktionspotential, Reorganisationsenergie und elektronische Kopplung zwischen dem Substrat und dem T1 Cu. Aufgrund des großen Einflusses des axialen Liganden wurden die strukturellen und spektroskopischen Eigenschaften des T1-Kupferzentrums in Ssl1-Varianten mit verschiedenen axialen Liganden untersucht. Die Ssl1-Varianten M295A/V/I/Y/F/T zeigten veränderte spektrale Eigenschaften, wie sie in vierfach koordinierten T1 Cu-Zentren mit einem axialen Sauerstoffliganden, z. B. einem Wassermolekül, beobachtet werden. Die Anwesenheit eines Wasserliganden wurde in den Kristallstrukturen der Ssl1-Varianten M295A/V/I/Y/F bestätigt. Die damit einhergehende tetraedrische Verzerrung der Koordinationsgeometrie deutet darauf hin, dass die Reorganisationsenergie für die CuII/CuI-Reduktion erhöht wurde. Zur Untersuchung des intramolekularen Elektronentransfers in Ssl1 wurde eine ruthenierte Variante mit einem [Ru(Bipyridin)2(Imidazol)]-Komplex hergestellt, der nahe des T1-Cu-Zentrums gebunden ist. Die ortsspezifische Ruthenierung erforderte ein einzelnes exponiertes Histidin an der Proteinoberfläche, das für die Reaktion zugänglich ist. Zu diesem Zweck wurde eine Ssl1 H85Q/H132Q/ΔC-Mutante erzeugt. Die Bildung des Ssl1-Ruthenium-Komplexes wurde durch Fluoreszenzspektroskopie nachgewiesen. Messungen des intramolekularen Elektronentransfers wurden durch kurze Fluoreszenzlebensdauern erschwert, die für die ruthenierte Ssl1-Probe beobachtet wurden, und es wurden andere Ansätze für Elektronentransfermessungen vorgeschlagen.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	14.12.2021
Dateien geändert am:	14.12.2021
Promotionsantrag am:	27.05.2021
Datum der Promotion:	20.09.2021