Dokument: Expression und Trafficking verschiedener Isoformen und Mutationen der humanen Phospholipidfloppase MDR3

Titel:	Expression und Trafficking verschiedener Isoformen und Mutationen der humanen Phospholipidfloppase MDR3
Weiterer Titel:	Expression and trafficking of different isoforms and mutations of the human phospholipid floppase MDR3
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=58221
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20211220-084441-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Linnemann, Doris [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 8,11 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 01.12.2021 / geändert 01.12.2021
Beitragende:	Prof. Dr. med. Kubitz, Ralf [Gutachter] Prof. Dr. med. Schmitt, Joachim [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	MDR3 (ABCB4) ist eine Phosphatidylcholinfloppase an der kanalikulären Membran der Hepatozyten. MDR3 transportiert Phosphatidylcholin zur Bildung gemischter Mizellen mit Cholesterin und Gallensalzen über die Membran in den Gallenkanalikulus. Neben der Isoform A von MDR3 wurden 1987 zwei weitere MDR3 Splice-Varianten - Isoform B und C - entdeckt, deren Funktion bisher nicht bekannt ist. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Isoform B in der Zellkultur exprimiert und deren subzelluläre Lokalisation untersucht. Die Isoform B zeigte sich nach Expression in HEK293- und HepG2-Zellen im Vergleich zu der Isoform A zu einem größeren Teil intrazellulär lokalisiert und kolokalisierte mit dem Degradations-Marker Ubiquitin. Eine rein intrazelluläre Funktion, ebenso der vorzeitige Abbau als funktionsloses Protein werden diskutiert. Mutationen im MDR3-Gen sind mit verschiedenen zum Teil schwerwiegenden Krankheiten assoziiert. Die krankheitsverursachenden Mechanismen und der Einfluss von MDR3-Mutationen auf die Funktion des Proteins sind in vielen Fällen nicht bekannt. Defekte des intrazellulären Traffickings des Proteins sind eine mögliche, schwerwiegende Auswirkung von Mutationen, welche die physiologische Funktion des aus dem betroffenen Allel resultierenden Proteins aufheben können. Die Mutationen S27G, S1076N, Q1174E und H1231Y wurden bei Patienten mit cholestatischen, MDR3-Defekt-assoziierten Krankheitsbildern gefunden. In einem zweiten Teil der Arbeit sollten die Mutationen hinsichtlich von Expressions- und Trafficking-Defekten in der Zellkultur untersucht werden. Die Mutationen wurden in einem Expressionsvektor - N-terminal YFP-getagged - erstellt, in HEK293- und HepG2-Zellen exprimiert und über konfokale Laserscanning-Mikroskopie mit dem Wildtyp verglichen. Als Kontrolle für einen Trafficking-Defekt wurde die bereits als Trafficking-Defekt Mutante charakterisierte Mutante I541F ebenfalls in einem Vektor erstellt und zur Kontrolle exprimiert. Zur untersucherunabhängigen Bewertung der Membrankolokalisation der Mutanten wurde ein Arbeitsablauf zur Detektion von Trafficking-Defekten weiterentwickelt. Weder nach initialer Durchmusterung der Präparate noch nach Auswertung der untersucherunabhängigen Kolokalisationsanalyse konnte ein Trafficking-Defekt der Mutanten S27G, S1076N, Q1174E und H1231Y vergleichbar mit I541F festgestellt werden. Die Mutationen wurden hinsichtlich ihrer Lokalisation im MDR3-Homologiemodell analysiert. Unter Berücksichtigung aktueller Studien und der Lokalisation in der Nähe der Nukleotidbindedomänen scheint ein Funktionsdefekt der Mutationen S1076N, Q1174E und H1231Y wahrscheinlich. Da die Aminosäure S27 im verwendeten Homologiemodell nicht abgebildet ist, ist die Bedeutung der Mutation S27G schwer vorherzusehen. Vorangegangene Studien erbrachten Hinweise auf einen Splicing-Defekt (1). Die Untersuchungen ergaben Hinweise auf eine stärkere Expression oder verminderte Degradation der Mutante S1076N. The phosphatidylcholinfloppase MDR3 (ABCB4) transports phosphatidylcholin from the inner to the outer leaflet of the membrane of the hepatocytes to form mixed micelles with bile salts and cholesterol in the bile canaliculi. In 1987 two additional splice variants – isoform B and C - of MDR3 were identified. The function of the isoforms B and C are not yet known. In the first part, isoform B was expressed in cell culture and its subcellular localization was examined. After expression in HEK293 and HepG2 cells, Isoform B, compared to isoform A, was found to be located intracellularly to a large extend and colocalized with the degradation marker ubiquitin. It is possible that isoform B has no function as a protein or is degraded in a premature form. An intracellular function of the variant B is also discussed. Mutations in the MDR3 gene are associated with various, partly serious diseases. In many cases, the disease-causing mechanisms and the influence of MDR3 mutations on the function of the protein are not known. Defects in intracellular trafficking of the protein are a possible, serious effect of mutations which can negate the physiological function of the protein resulting from the affected allele. The mutations S27G, S1076N, Q1174E and H1231Y were found in patients with cholestatic, MDR3-defect-associated liver diseases. In the second part of the thesis, mutations regarding expression and trafficking defects were examined. The mutations were created in an expression vector - N-terminal YFP-tagged -, expressed in HEK293 and HepG2 cells and compared with the wild type by confocal laser scanning microscopy. As a control for a trafficking defect, the mutant I541F, already characterized as a trafficking defect mutant, was also created in a vector and expressed in the cells. A workflow for the detection of trafficking defects was further developed for the independent evaluation of the membrane colocalization of the mutants. A trafficking defect comparable to I541F was not detected in the mutants S27G, S1076N, Q1174E and H1231Y, neither after initial screening of the specimens nor after evaluation of the investigator-independent colocalization analysis. The mutations were analyzed for their location in the MDR3 homology model. Taking current studies and the location near the nucleotide binding domains into account, a functional defect of the mutations S1076N, Q1174E and H1231Y seems likely. Since the amino acid S27 is not shown in the homology model used, the meaning of the mutation S27G is difficult to predict. Previous studies indicated a splicing defect. The results suggest a higher expression or reduced degradation of the mutant S1076N.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	20.12.2021
Dateien geändert am:	20.12.2021
Promotionsantrag am:	05.11.2020
Datum der Promotion:	25.11.2021