Dokument: Vesicular glutamate transporters possess multifunctional properties due to large pores

Titel:	Vesicular glutamate transporters possess multifunctional properties due to large pores
Weiterer Titel:	Vesikuläre Glutamat Transporter besitzen multifunktionale Eigenschaften aufgrund großer Poren
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=58163
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20211202-104025-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	M.Sc. Kolen, Bettina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 20,72 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 26.11.2021 / geändert 26.11.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Christoph Fahlke [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Christine R. Rose [Gutachter]
Stichwörter:	VGLUT, synapse, chloride, glutamate, patch clamp, channel, transporter
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Vesikuläre Glutamat Transporter (VGLUTs) vermitteln die Aufnahme des exzitatorischen Neurotransmitters Glutamat in synaptische Vesikel und sind damit maßgeblich an der Stärke exzitatorischer synaptischer Transmission beteiligt. Sie sind nicht nur von hoher physiologischer Bedeutung, sondern auch funktionell einzigartig: VGLUTs sollen sekundär aktive Glutamat Transporter sein, können aber auch als Anionenkanäle oder als Na+-gekoppelte Phosphat-Transporter funktionieren. Weder der Mechanismus, noch die Funktion sind bis heute komplett verstanden. Um VGLUTs mittels elektrophysiologischer Patch-Clamp-Techniken zu charakterisieren, verwendeten wir einen VGLUT1, der Mutationen in den Targeting-Signalen in den amino- und carboxy-terminalen Regionen trägt. Wir exprimierten VGLUT1PM heterolog als GFP-Fusionsprotein in HEK293T Zellen und untersuchten die Funktion des Anionenkanals mittels einer Kombination aus Ganzzell-Patch-Clamp, Rauschanalyse und Fluoreszenzintensitätsmessungen. Wir fanden heraus, dass VGLUT1PM einen stark einwärts rektifizierenden pH- und Cl--abhängigen Chloridkanal mit einer lyotropen Anionenselektivität und einer Einzelkanalamplitude von ~24 fA mit Cl- als permeables Anion formt. Wir konnten zudem Glutamat-Ströme messen. Überraschender Weise waren auch verschiedene große Anionen wie Gluconat oder Aspartat permeabel für VGLUT1PM. In Experimenten mit externem Chlorid, haben sich Gluconat und Aspartat durch ein negativeres Umkehrpotential von Glutamat unterschieden. Somit fungiert VGLUT1 im synaptischen Vesikel als hoch selektiver Glutamat Transporter oder Kanal mit einer großen Pore. Durch den Block des Cl--Kanals durch luminales oder zytoplasmatisches Glutamat konnten wir zeigen, dass die Bindung von Glutamat gegenüber Cl- stärker ist und beide Ionen zumindest teilweise, wenn nicht sogar den gleichen Permeationsweg teilen. Eine Punktmutation, H120A, die den Transport von Glutamat beeinflussen soll, zeigte in unseren Messungen ein verändertes Kanal-Gating mit deutlich erhöhten makroskopischen Stromamplituden, die durch eine verdoppelte Einzelkanalamplitude entstehen. Zudem konnten wir Änderungen in der Anionenselektivität und vor allem eine Reduzierung der Glutamat Permeabilität feststellen. Unsere Ergebnisse demonstrieren, dass VGLUT als Anionenkanal mit einer großen Pore funktionieren kann, der in mehreren Konformationsänderungen öffnet. Damit geben wir neue Einblicke in die verschiedenen Transportfunktionen von vesikulären Glutamat Transportern. Vesicular glutamate transporters (VGLUTs) mediate the uptake of the excitatory neurotransmitter glutamate into synaptic vesicles and are thus crucially involved in the strength of excitatory synaptic transmission. They are not only of high physiological importance, but also functionally unique: VGLUTs are thought to be secondary active glutamate transporters, but can also function as anion channels or as Na+-coupled phosphate transporters. Neither the mechanism nor the function are completely understood to date. To characterize VGLUTs using electrophysiological patch clamp techniques, we used a VGLUT1 with mutations in targeting signals in the amino- and carboxy-terminal regions and heterologously expressed VGLUT1PM as a GFP fusion protein in the plasma membrane of HEK293T cells. We examined the function of the anion channel using a combination of whole cell patch clamp, noise analysis and fluorescence intensity measurements. We found that VGLUT1PM forms a strongly inward rectifying pH- and Cl--dependent chloride channel with a lyotropic anion selectivity and a single channel amplitude of ~24 fA with Cl- as permeant anion. We were also able to measure glutamate currents. Surprisingly, several large anions such as gluconate or aspartate were also permeable to VGLUT1PM. In experiments with external chloride, gluconate and aspartate differ from glutamate in much more negative reversal potentials. Thus, VGLUT1 functions as a highly selective glutamate transporter or channel with a large pore within synaptic vesicles. By blocking the Cl- channel with luminal or cytoplasmic glutamate, we showed that the binding of glutamate is stronger compared to Cl- and that both ions share at least part, if not the same, permeation pathway. A point mutation, H120A, which is thought to affect the transport of glutamate, showed altered channel gating in our measurements with markedly increased macroscopic current amplitudes due to a twofold higher single channel amplitude. In addition, we observed changes in anion selectivity and, most importantly, reduced glutamate permeability. Our results demonstrate that VGLUT1 can function as an anion channel with a large pore that opens within multiple conformational changes and provide new insights into the different transport functions of vesicular glutamate transporters.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	02.12.2021
Dateien geändert am:	02.12.2021
Promotionsantrag am:	04.05.2021
Datum der Promotion:	03.11.2021