Dokument: Vom Labor in die Klinik: Molekulare Charakterisierung zirkulierender Tumorzellen zur Selektion zielgerichteter Therapien am Beispiel des metastasierten Mammakarzinoms

Titel:	Vom Labor in die Klinik: Molekulare Charakterisierung zirkulierender Tumorzellen zur Selektion zielgerichteter Therapien am Beispiel des metastasierten Mammakarzinoms
Weiterer Titel:	From Bench to Bedside: Molecular Characterization of Circulating Tumor Cells from Metastatic Breast Cancer Patients to Select Targeted Therapies
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=58105
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20221207-093503-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Franken, André [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,74 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 21.11.2021 / geändert 21.11.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Hans Neubauer [Gutachter] Prof. Dr. Egelhaaf, Stefan [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Brustkrebs ist die weltweit häufigste Krebserkrankung bei Frauen. Zur Behandlung hat sich im Laufe der letzten Jahrzehnte die zielgerichtete Therapie als das bevorzugte Vorgehen etabliert. Der prädiktive Nutzen der Analyse des Primärtumors ist für die metastasierte Situation jedoch limitiert und auch die regelmäßige Entnahme von Biopsien der Metastasen stellt einige Herausforderungen dar. Eine Lösung dieses Problems könnte in der Analyse von Tumormaterial im Blut der Patientinnen liegen, was als Liquid Biopsy bezeichnet wird. Einen der in Frage kommenden Analyten stellen dabei zirkulierende Tumorzellen (CTCs) dar. CTCs sind sowohl beim Mammakarzinom (MK) als auch bei Tumoren anderer Entitäten ein unabhängiger prognostischer Faktor. Ihr klinischer Nutzen, der bislang noch nicht abschließend gezeigt werden konnte, wird derzeit in zahlreichen Studien untersucht und wurde auch in dieser Dissertation adressiert. Dazu sollten Methoden zur molekularen Charakterisierung von CTCs mit dem Ziel der Identifikation geeigneter zielgerichteter Therapien entwickelt und schließlich in die klinische Anwendung übertragen werden. Im ersten Teil wurde ein Next Generation Sequencing (NGS)-basierter Assay zur Detektion von Mutationen im ESR1-Gen auf Einzel-CTC-Ebene entwickelt. Entsprechende Mutationen wurden nur bei Patientinnen nach Behandlung mit östrogendeprivierender Therapie detektiert, gegenüber der sie Resistenzen vermitteln. In Gewebe-Biopsien, die vor der CTC-Analyse entnommen wurden, konnten diese Mutationen nicht gefunden werden. Allerdings wiesen zwei von zwei Biopsien der Metastastasen, die nach der CTC-Analyse detektiert wurden, dieselben Mutationen auf. Diese Ergebnisse zeigen, dass mittels CTC-Analyse ein frühzeitiger Nachweis therapierelevanter ESR1-Mutationen möglich ist und Heterogenität auf Einzelzellebene dargestellt werden kann. Zusätzlich zur Mutationsanalyse könnte insbesondere die Untersuchung von lebenden CTCs in der Zukunft relevant werden, da sich aus ihnen ein Maximum an Informationen, einschließlich der Möglichkeit der in vitro-Therapie-Testung, gewinnen lässt. Da die Kultivierung von CTCs unter anderem wegen deren Seltenheit im Blut mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden ist, wurde mit Hilfe des Parsortix-Systems eine Methode entwickelt, um eine größere Menge lebender CTCs aus diagnostischen Leukapherese (DLA)- Produkten anzureichern. Aus drei von zwölf DLA-Produkten konnten erfolgreich CTCs kultiviert werden. Dabei war das DLA-Produkt dem peripheren Blut als Ausgangsmaterial für die CTC-Kultivierung überlegen. Anschließend wurde in einer Proof-of-Concept-Studie eine longitudinale und multiparametrische Liquid Biopsy-Analyse zur Identifikation einer geeigneten Therapie für eine Index-Patientin mit metastasiertem MK eingesetzt. Dabei kristallisierte sich die AKT1 E17K-Mutation als vermutlicher Treiber der Metastasierung und als ein mögliches Ziel für eine zielgerichtete Therapie heraus. Auf dieser Basis wurde Everolimus als geeignetes Therapeutikum ausgewählt. Während der CTC-basierten Kombinationstherapie aus Everolimus, Tamoxifen und Denosumab kam es zu einer Reduktion der CTC-Zahl um 97,3%. Die Tumorlast der Patientin zeigte sich unter dieser Therapie über Monate stabil. Darauf aufbauend wurde schließlich ein Multiplex-PCR-basiertes NGS-Panel entwickelt, das die für die zielgerichtete Therapie beim MK relevantesten genomischen Positionen in den Genen PIK3CA, ESR1, AKT1 und ERBB2 abdeckt, in denen Mutationen häufig erst im Laufe des Fortschreitens der Erkrankung erworben werden. Der Assay wurde mit Hilfe von Zelllinienzellen validiert und an CTCs von metastasierten MK-Patientinnen getestet. Er ermöglicht die Identifikation von Mutationen, die sich mit zugelassenen zielgerichteten Therapien ansteuern lassen, und kann unmittelbar in der klinischen Diagnostik eingesetzt werden. Insgesamt unterstreichen diese Ergebnisse das prädiktive Potenzial der Analyse von Liquid Biopsies und CTCs. Es wurde gezeigt, dass solche Analysen ermöglichen, Strukturen, wie z.B. Mutationen im ESR1-Gen und anderen Genen, zu identifizieren, die im Primärtumor nicht nachweisbar wären und die durch zielgerichtete Therapien adressiert werden können. Dabei könnten insbesondere longitudinale und multiparametrische Liquid Biopsy-Analysen erfolgsversprechend sein. Die hier gezeigte Proof-of-Concept-Studie, die in dieser Form bislang einmalig ist, zeigt den klinischen Nutzen einer solchen Analyse – einschließlich eines Tests in Frage kommender Therapeutika an kultivierten CTCs. Die Ergebnisse dieser Dissertation werden dazu beitragen, das CTC-Feld voranzubringen, die molekulare Charakterisierung von CTCs zur Therapie-Findung einzusetzen und schließlich die Behandlung der Patientinnen zu optimieren. Breast cancer (BC) is the leading type of cancer for women worldwide. Over the last decades, targeted therapy has become the preferred approach to treat BC. However, the predictive utility of the primary tumor is limited once the tumor has metastasized and obtaining serial biopsies of metastatic lesions is challenging. Thus, the idea of deriving information about the tumor from liquid biopsies by analyzing e.g. circulating tumor cells (CTCs) is an appealing concept. CTCs are an independent prognostic indicator of progression free and overall survival in breast cancer and other cancer types. Their predictive utility, however, is still under investigation and was also addressed in this study. To that aim, methods to characterize CTCs for the identification of a suitable targeted therapy were developed and applied in the clinical situation. In the first part, single CTCs were analyzed with a next generation sequencing (NGS) approach for the ESR1 coding region. ESR1 mutations were detected exclusively in patients treated with estrogen deprivation therapy to which they confer resistance. The mutations were absent in tissue biopsies of the primary tumor and were detected only in metastases obtained after CTC characterization. These results show that a CTC analysis enables the early detection of ESR1 mutations relevant for therapy and demonstrate heterogeneity on single cell level. In addition to mutation analysis, the analysis of viable CTCs could be of particular interest since that promises to obtain a maximum of information including performing in vitro drug screening assays. However, culturing CTCs is a mayor challenge mainly because of their rareness in blood. This was addressed by combining the diagnostic leukapheresis (DLA) and a microfluidic enrichment to obtain large numbers of viable CTCs. CTCs could be cultured from 3 out of 12 patients and it was shown that DLA product was superior to peripheral blood as the CTC source for cultivation. Furthermore, a longitudinal and multiparametric proof-of-concept study of a single index patient suffering from metastasized BC over a time period of three years with the aim to understand the clinical utility of CTCs was performed. An observed AKT1 E17K mutation, which was not detected in the primary tumor, was hypothesized to be the driver of the metastatic process. The findings led to selection of everolimus combined with tamoxifen and denosumab to target the AKT1 pathway. CTC numbers dropped by 97.3% during this CTCbased treatment. The observations on CTC numbers associated with the imaging of the metastatic burden. Finally, a multiplex PCR-based NGS panel covering genomic positions in the PIK3CA, the ESR1, the AKT1, and the ERBB2 genes most relevant for selection of a targeted therapy to treat metastatic BC was established. Such mutations are often not present in the primary tumor but acquired during the course of the disease. The assay was validated using cell line cells and tested with CTCs from metastatic breast cancer patients. It can be readily applied in the clinical practice to detect mutations that can be targeted with approved therapies. All together, these results underline the predictive potential of liquid biopsies and CTCs. Such analyses enable the detection of targets for targeted therapy – such as mutations in the ESR1 and other genes – that cannot be detected in the primary tumor or are acquired during the course of the disease. Longitudinal and multiparametric liquid biopsies could be of particular interest: The proof of concept-study shown here highlights the clinical utility of such an analysis – including in vitro drug testing on cultured CTCs. The findings of this thesis will advance the CTC field, will support the usage of a molecular characterization of CTCs for selection of targeted therapies and will finally optimize the treatment of patients.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	07.12.2022
Dateien geändert am:	07.12.2022
Promotionsantrag am:	12.05.2020
Datum der Promotion:	27.11.2020