Dokument: Entwicklung eines in-vitro-Modells zur Untersuchung des sekundären Wundprogresses in der Stase-Zone von Verbrennungsverletzungen

Titel:	Entwicklung eines in-vitro-Modells zur Untersuchung des sekundären Wundprogresses in der Stase-Zone von Verbrennungsverletzungen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=57982
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20211110-104853-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Wergen, Niklas Markus [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 18,70 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 07.11.2021 / geändert 07.11.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Suschek, Christoph V. [Gutachter] PD Dr. Mahotka, Csaba [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Der sekundäre Wundprogress ist weiterhin ein großes Problem in der Verbrennungsmedizin. Er beschreibt das zeitlich verzögerte Nachtiefen und Wachsen von Verbrennungswunden, das vor allem in der von Jackson beschriebenen Stase-Zone auftritt. Bei den Betroffenen kann dies den Heilungsverlauf deutlich verlangsamen, zu verstärkter Narbenbildung führen und letztlich Einschränkungen der Lebensqualität bedeuten. Als ursächlich für diesen Prozess werden in der Literatur hauptsächlich ischämische und entzündliche Mechanismen beschrieben. Vollständig verstanden ist der sekundäre Wundprogress bislang jedoch nicht, zumal wenig Erkenntnisse zu den Prozessen auf zellulärer Ebene vorliegen. In Ermangelung an guten in-vitro Modellen wurden in dieser Arbeit zwei Modelle für Verbrennungsverletzungen entwickelt, vor allem um die zellulären Prozesse in der Stase-Zone von Verbrennungen besser zu verstehen. Dafür wurden humane dermale Fibroblasten (HDF) aus Hautpräparaten isoliert und die geschaffenen Zellkulturen anschließend mittels zwei verschiedenen Versuchsaufbauten für wenige Sekunden sehr stark erhitzt. Anhand eines Resazurin-Reduktions-Assay konnte die Abnahme der Viabilität nach der Hitzeexposition beobachtet werden. Hier wurde deutlich, dass bei den gewählten Expositionsparametern ein Großteil der HDF erst im Verlauf der ersten 24 Stunden in den Zelltod übergeht und somit einen verzögerten Zelltod aufzeigten. Zur Differenzierung dieses Zelltodes wurde ein Apoptose Assay nach Nicoletti per Durchflusszytometrie durchgeführt. Aufgrund des nicht eindeutigen Ergebnisses wurden weitere Methoden wie bspw. ein Western-Blot verwendet. Hierbei wurde das Auftreten von Poly(ADP-ribose)-Polymerase 1 (PARP), bzw. cleaved-PARP, sowie verschiedener Hitzeschockproteine untersucht. Es konnte ein deutlich hochreguliertes PARP festgestellt werden, was Rückschlüsse auf eine massive DNA-Schädigung zulässt. Das auf eine Apoptose hinweisende cleaved-PARP konnte nicht nachgewiesen werden. Ebenfalls wurde untersucht, inwiefern apoptosemodulierende Pancaspase-Inhibitoren, GDF-5, ROS-Scavenger oder ein Translationshemmer den beobachteten Zelltod beeinflussen können. Dabei gelang es nicht den Zelltod zu hemmen, es ergaben sich aber wichtige Hinweise auf die grundlegenden Mechanismen. Letztlich wurden zu verschiedenen Zeitpunkten ein Tunel-Assay und eine Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt. Die Zusammenschau der Ergebnisse macht deutlich, dass Apoptose bei den gewählten Expositionsparametern kaum abläuft. Anhand der verwendeten Modelle konnte gezeigt werden, dass das Phänomen des sekundären Wundprogresses auch in-vitro vergleichbar zu beobachten ist. Dies legt nahe, dass dieser Prozess nicht rein durch ischämische oder entzündliche Mechanismen erklärt werden kann, sondern auch intrinsische Faktoren der geschädigten Zellen von Bedeutung sind. Auch wenn apoptotische Prozesse bei den hier gewählten Versuchsbedingungen keine Relevanz hatten, können anhand der Modelle zukünftig weitere mögliche Einflussfaktoren wie bspw. reaktive Sauerstoffspezies oder die Rolle von PARP untersucht werden. Burn wound progression remains an important issue in the treatment of burn patients. This process, which according to Jackson's Burn model takes place in the Stasis Zone, leads to a delayed deepening as well as growth of burn wounds and can cause a conversion to a higher burn grade. Thus, it delays the healing process, can cause hypertrophic scarring and often negatively influences the patient’s quality of life. Various factors are known to have an influence on burn wound progression, most frequently mentioned are mechanisms like reduced perfusion as well as overwhelming inflammation. However, generally, burn wound progression is poorly understood and, in particular, there is very little knowledge about the processes on the cellular level In the absence of a good in-vitro model for burn wounds, two models were developed and discussed in this work, especially to examine the cellular processes in Stasis Zone. For this purpose, human dermal fibroblasts (HDF) were isolated from tissue donated by healthy patients after abdominoplasty. The resulting cell cultures were treated following two different procedures, each with a short but intense heat exposure. The decrease in viability resulting from this treatment was measured using a resazurin reduction assay. It was observed that, depending on the specific parameters of the exposure, a large part of the HDF survived initially, but died a delayed cell death later within the following 24 hours. To investigate and understand this delayed cell death more accurately, an apoptosis assay according to Nicoletti was performed. In this context, because of ambiguous results, additional methods such as a Western blot, were used. Here, the appearance of poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP), cleaved PARP and some types of heat shock proteins were measured. A great amount of PARP indicated a massive DNA damage, while cleaved-PARP, that would have indicated an apoptosis, was not detected. Furthermore, it was examined, how apoptosis-modulating pancaspase inhibitors, GDF-5, ROS scavenger or a translation inhibitor can influence delayed cell death. These substances failed to inhibit cell death, but important clues towards understanding the fundamental mechanism could be gathered. Finally, a Tunel-Assay and a fluorescence microscopy were performed at various times after the heat exposure. In summary, the results of this analysis, indicate that it is unlikely that, under the chosen exposure parameters, apoptosis played a crucial role in the occurrence of delayed cell death. Based on the models used, it could be shown that the phenomenon of secondary wound progression can also be observed in a comparable manner in-vitro. This suggests that wound progression cannot be explained solely by ischemic or inflammatory mechanism. Instead, intrinsic processes within the damaged cells also play a role. Even though there were no apoptotic processes found here, the developed models will allow further research on the fundamental mechanisms, e.g. on the role of PARP or ROS.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	10.11.2021
Dateien geändert am:	10.11.2021
Promotionsantrag am:	21.06.2021
Datum der Promotion:	02.11.2021