Dokument: Untersuchungen zu viralen, zellulären und pharmakologischen Determinanten des Uncoatings von HIV-1 in vitro
| Titel: | Untersuchungen zu viralen, zellulären und pharmakologischen Determinanten des Uncoatings von HIV-1 in vitro | |||||||
| Weiterer Titel: | Studies on viral, cellular and pharmacological determinants of HIV-1 uncoating in vitro | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=57829 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20211103-113918-2 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Tischler, Sebastian [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Münk, Carsten [Gutachter] Prof. Dr. Schaal, Heiner [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | HIV, HIV-1, Uncoating, Capsid, Core | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Der Begriff „Uncoating“ bezeichnet im Replikationszyklus des Humanen Immundefizienz-Virus 1 (HIV-1) den Prozess des Capsidzerfalls nach der Fusion der Virus- mit der Wirtszellmembran. In der jüngeren Vergangenheit konnten mit Hilfe neuer Nachweismethoden virale, wirtszell-spezifische und pharmakologische Einflussfaktoren identifiziert werden, deren Effekte auf das Uncoating im Rahmen dieser Arbeit in vitro experimentell gemessen und untersucht wurden.
Hierfür wurde zunächst ein Uncoating Assay aus der Literatur modifiziert, insgesamt wurden drei verschiedene experimentelle Herangehensweisen getestet. Zunächst wurde versucht, ein Fusionsprotein aus dem viralen Protein R (Vpr) und NanoLuciferase in die viralen Vektoren zu inkorporieren, um es nach erfolgter Transduktion in den Wirtszellen messen zu können. Dieser Ansatz erbrachte keine reproduzierbaren Ergebnisse. Auch die Verwendung eines NanoLuc-Split-Proteins, das durch Protein-Protein-Interaktion in der Wirtszelle ein messbares Signal erzeugen sollte, eignete sich nicht für die Gewinnung statistisch valider Daten. Mit Hilfe des dritten Ansatzes jedoch, der Verwendung einer translatierbaren Reporter-mRNA in virale Vektoren, konnten umfangreiche Messungen zu verschiedenen Determinanten des Uncoatings durchgeführt werden. Diese Reporter-mRNA kodiert für die NanoLuciferase und wird durch das Uncoating dem Translationsapparat der Zielzelle zugänglich, muss also nicht erst in cDNA umgeschrieben werden. Sie wird im Zytoplasma in funktionsfähige Luciferase translatiert, deren Signal luminometrisch messbar wird. Durch die Verwendung der NanoLuciferase als sehr sensitivem Reporterenzym gelang es, durch Einsatz verhältnismäßig geringer Mengen an Reagenzien signifikante Ergebnisse zu erzielen. Die gewonnenen Daten zeigen, dass der frühe Infektionszyklus von HIV-1 auf verschiedenste Weisen beeinflussbar ist. So könnten beispielsweise pharmakologische Capsiddestabilisatoren in Zukunft eine neue Klasse der HIV-1-Therapeutika in vivo darstellen, da sie in vitro einen sehr starken Effekt auf das Uncoating zeigten. Hier sind allerdings weitere Untersuchungen nötig, bevor die Substanzen in der Humanmedizin nutzbar werden könnten. Auch die Erkenntnisse über virale und wirtszell-spezifische Determinanten des Uncoatings bieten interessante Ansatzpunkte für weitere Studien. Gerade die Kombination der viralen, zellulären und pharmakologischen Einflüsse jedoch bietet noch viel Raum für weitere Untersuchungen auf mögliche Synergieeffekte, um eine möglichst hohe Effektivität in der Inhibition des frühen Infektionszyklus zu ermöglichen. Langfristig könnten so möglicherweise neue Ansätze in der Therapie der HIV-1-Infektion in vivo gefunden werden.In the replication cycle of human immunodeficiency virus 1 (HIV-1), the term "uncoating" refers to the process of capsid decay following the fusion of the viral and host cell membranes. In the recent past, viral, host cell-specific and pharmacological factors have been identified with the aid of new detection methods. The effects of these factors on uncoating were experimentally measured and investigated in vitro in this work. For this purpose, an uncoating assay published in literature was first modified, and a total of three different experimental approaches were tested. First, an attempt was made to incorporate a fusion protein consisting of viral protein R (Vpr) and NanoLuciferase into the viral vectors, in order to be able to measure it in the host cells after transduction had taken place. This approach did not yield reproducible results. The use of a NanoLuc split protein, which was supposed to generate a measurable signal by protein-protein interaction in the host cells also proved not suitable for obtaining statistically valid data. However, the third approach, the use of a translatable reporter mRNA in viral vectors, allowed extensive measurements to be made on various determinants of uncoating. This reporter mRNA codes for nanoluciferase and becomes accessible to the translational apparatus of the target cell through uncoating, thus not having to be transcribed into cDNA first. In cytoplasm, it is translated into functional luciferase, whose signal can be measured luminometrically. Nanoluciferase being a very sensitive reporter enzyme, it was possible to obtain significant results by using relatively small amounts of reagents. The data obtained show that the early infection cycle of HIV-1 can be influenced in a variety of ways. For example, pharmacological capsid destabilizers may represent a new class of HIV-1 therapeutics in vivo in the future, as they showed a very strong effect on uncoating in vitro. However, further studies are needed before the compounds could become useful in treating human individuals infected with HIV-1. The findings on viral and host cell-specific determinants of uncoating also provide interesting approaches for further studies. Nevertheless, the combination of viral, cellular and pharmacological influences in particular offers much scope for further investigation into possible synergistic effects to maximize effectiveness in inhibiting the early infection cycle of the virus. In the long term, this could potentially lead to new approaches in therapy of HIV-1 infection in vivo. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 03.11.2021 | |||||||
| Dateien geändert am: | 03.11.2021 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 12.04.2021 | |||||||
| Datum der Promotion: | 21.10.2021 |
