Dokument: Erschließung kombinatorisch wirksamer antibakterieller Sekundärmetabolite

Titel:	Erschließung kombinatorisch wirksamer antibakterieller Sekundärmetabolite
Weiterer Titel:	Exploitation of combinatorially effective antibacterial secondary metabolites
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=57801
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20211123-112041-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hage-Hülsmann, Jennifer [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 14,79 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 21.10.2021 / geändert 21.10.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Jun.-Prof. Dr. Axmann, Ilka M. [Gutachter]
Stichwörter:	kombinierte antibakterielle Wirkungen, Prodigiosin, Serrawettin W1, N‐Myristoyltyrosin, Biotenside, Rhodobacter capsulatus, heterologe Triterpenproduktion, Cycloartenol, Lupeol
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Durch antibiotikaresistente Bakterien verursachte Infektionen sind heutzutage ein stetig wachsendes lebensbedrohliches Problem des globalen Gesundheitssystems, für welches dringend Lösungen gefunden werden müssen. Kombinatorische Applikationen zweier Verbindungen zur Steigerung der Effektivität von Behandlungen stellen eine Lösungsstrategie dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde über einen mikrobiologisch-biotechnologischen Ansatz diesbezüglich ein Beitrag geleistet. Dazu wurde als Erstes geprüft, ob die Natur als Inspirationsquelle für kombinatorische antibakterielle Stoffkombinationen dienen kann. Als Zweites wurde untersucht, ob das phototrophe Bakterium Rhodobacter capsulatus als Expressionswirt etabliert werden kann, um Zugang zu bioaktiven Triterpenen durch heterologe Synthese zu erlangen. Im Rahmen der Forschungsarbeiten zur ersten Fragestellung diente das Bodenbakterium Serratia marcescens als Ausgangspunkt, da dieses das hydrophobe antibakterielle Tripyrrol Prodigiosin und das Biotensid Serrawettin W1 bildet und native Prozesse zur Koproduktion sowie gemeinsam verstärkten Bioaktivität bereits postuliert wurden. Anhand von Corynebacterium glutamicum sowie einigen bakteriellen Modellstämmen als Vertreter der ESKAPE-Gruppe wurden in der vorliegenden Arbeit hiervon ausgehend antibakterielle Effekte dieser und ähnlicher Substanzen bzw. Substanzkombinationen untersucht. Es konnte eine konzentrationsabhängige, kombinatorisch verstärkte, antibiotische Aktivität von Prodigiosin und Serrawettin W1 nachgewiesen werden. Somit wurden weitere Stoffzusammensetzungen davon abgeleitet. Es zeigte sich, dass Prodigiosin zusammen mit diversen (Bio)Tensiden (Triton X-100, SDS, Tween 20, Rhamnolipide, Mannosylerythritollipide, N-Myristoyltyrosin) verstärkte antibakterielle Wirkungen besitzt. Die gleichzeitige Applikation mit N-Myristoyltyrosin verringerte die zur Inhibition des bakteriellen Wachstums benötigte Menge an Prodigiosin um drei Größenordnungen. Des Weiteren zeigten Analysen des antibakteriellen Effekts gegen C. glutamicum auf Einzelzellebene bei subletalen Konzentrationen beider Verbindungen heterogene Zellreaktionen, aber keine Resistenzentwicklungen, was insgesamt mit der Störung der Membranintegrität als einem der angenommenen Hauptmechanismen der antibiotischen Wirkung dieser Naturstoffe einhergehen kann. Während der Einsatz diverser Prodigiosin-Derivate keine verbesserte separate sowie mit N-Myristoyltyrosin kombinierte antibakterielle Aktivität zeigte, stellte sich heraus, dass N-Myristoyltyrosin Wirkstärken von anderen antibakteriellen Verbindungen deutlich und sehr unterschiedlich modifizieren kann. Neben der vermutlichen Solubilisierung von spezifischen hydrophoben Verbindungen wie eben Prodigiosin unterstützt das Biotensid anscheinend den komplexen Eintritt von Aminoglykosid-Antibiotika in bakterielle Zellen, was in einer verstärkten gemeinsamen antibiotischen Wirkung sichtbar wurde. Außerdem wies N-Myristoyltyrosin in Kombination mit spezifischen antibakteriellen Verbindungen, nämlich den Triterpenen Ursol- und Oleanolsäure, antagonistische Effekte auf. Zusammengenommen wurde damit gezeigt, dass die Natur als Inspirationsquelle für kombinatorische antibakterielle Stoffkombinationen dienen kann. Im Rahmen der Bearbeitung der zweiten Fragestellung diente das phototrophe Bakterium Rhodobacter capsulatus als Ausgangspunkt zur Erstellung einer neuen Plattform zur Bereitstellung von Verbindungen aus der relevanten Naturstoffgruppe der Terpene. Dazu wurde sowohl die Bildung der linearen Triterpenvorstufen Squalen und 2,3-Oxidosqualen als auch die Biosynthese des pflanzlichen Sterols Cycloartenol sowie des pentazyklischen Lupeols erfolgreich durch Expression von Genen aus Arabidopsis thaliana realisiert. Im Zuge dessen wurden weder das Wachstum noch die intrinsischen Carotinoidlevel des Wirts R. capsulatus von der heterologen Triterpenbiosynthese negativ beeinflusst. Die komparative Evaluierung verschiedener Squalen- und Cycloartenolsynthasen aus unterschiedlichen Herkunftsorganismen sowie die Anwendung diverser Metabolic-Engineering-Strategien am Isoprenoidbiosyntheseweg des Wirts, der die C15-Triterpenvorstufenverbindung Farnesylpyrophosphat (FPP) bereitstellt, erbrachten höchst Fall-spezifische Ergebnisse. Während die Squalenproduktion stark von der jeweiligen Synthase abhing, war dies für die Cycloartenolsynthese nicht ausschlaggebend. Dementsprechend wurde der maximale Squalentiter von 90,90 mg/L mit einer Squalensynthase aus Methylococcus capsulatus und Koexpression der ispA-kodierten FPP-Synthase und der höchste Cycloartenoltiter von 1,13 mg/L mit der aus A. thaliana stammenden Cycloartenolsynthase bei Deletion der wirtseigenen FPP-umsetzenden Geranylgeranylpyrophosphat-Synthase erreicht. Insgesamt wurde die Notwendigkeit individueller Justierungen zur Produktionsoptimierung der heterologen Terpenbiosynthese in R. capsulatus deutlich. Ferner konnte für die Lupeolsynthase aus A. thaliana und eine der beiden eingesetzten myxobakteriellen Cycloartenolsynthasen jeweils die Bildung eines zusätzlichen Triterpenprodukts in vertiefenden massenspektrometrischen Analysen detektiert werden. Diese deuteten darauf hin, dass es sich um oxygenierte Derivate der jeweiligen Verbindungen Lupeol und Cycloartenol handeln könnte. Zusammengenommen wurde das phototrophe Bakterium R. capsulatus als Expressionswirt zur heterologen Herstellung von Triterpenen und zur Charakterisierung dazu relevanter Enzyme etabliert. Insgesamt konnten somit im Rahmen dieser Arbeit zwei mikrobiologisch-biotechnologische Ansätze zur Erschließung von kombinatorisch antibakteriell wirksamen Sekundärmetaboliten aufgezeigt werden. Nowadays infections caused by antibiotic resistant bacteria are a continuously growing, global, life-threatening health issue for which solutions need to be found. Combinatorial applications of two compounds for increasing the effectiveness of medical treatments are one solution strategy. Within the scope of the present thesis, a contribution was made by applying a microbiological and biotechnological approach. Therefore, it was investigated if nature can serve as a source of inspiration for combinatorial antibacterial combinations of compounds. Moreover, it was evaluated if the phototrophic bacterium Rhodobacter capsulatus could be established as expression host for improving the access to bioactive triterpenes by means of heterologous biosynthesis. In order to address the first research question, the soil bacterium Serratia marcescens was chosen to be the starting point of research, since it forms the hydrophobic antibacterial tripyrrole prodigiosin and the biosurfactant serrawettin W1 and native processes of co-production as well as increased combined bioactivities are postulated. Using Corynebacterium glutamicum and some bacterial model strains of the ESKAPE-group, antibacterial effects of those two compounds as well as of similar compounds and combinations thereof were evaluated here. Prodigiosin and Serrawettin W1 showed concentration dependent, combinatorially increased, antibiotic activities. Thus, further combinations were derived of that natural composition. It was found, that prodigiosin possesses increased antibacterial combinatorial effects together with diverse (bio-)surfactants (Triton X-100, SDS, Tween 20, rhamnolipids, mannosylerythritollipids, N-myristoyltyrosine). The simultaneous application with N-myristoyltyrosine reduced the required amount of prodigiosin for inhibition of bacterial growth by three orders of magnitude. Furthermore, single cell analysis showed that sublethal concentrations of both compounds in combination evoked heterogeneous cell reactions of C. glutamicum. At the same time, no development of resistance was detected, altogether in accordance with the main antibiotic mechanism of both natural compounds, namely membrane disturbance. While the application of diverse derivatives of prodigiosin did not result in improved separate or combined antibacterial activities with N-myristoyltyrosine, the latter was able to modify the strength of antibacterial effects of diverse compounds in different ways. Besides the presumed solubilisation of specific hydrophobic compounds like prodigiosin, the biosurfactant seems to support the complex entrance of aminoglycoside antibiotics into bacterial cells, which was detected as an increased antibiotic effect. In addition, N-myristoyltyrosine showed antagonistic effects when applied in combination with specific antibacterial compounds, namely the triterpenes ursolic and oleanolic acid. In conclusion, nature was proven to be a valuable source of inspiration for combinatorial active antibacterial compositions of bioactive compounds. In order to address the second research question, the phototrophic bacterium R. capsulatus was chosen to be the starting point of research for the generation of a novel platform to provide compounds of the relevant natural product group of terpenes. For this purpose, the formation of the linear triterpene precursor squalene and 2,3-oxidosqualene as well as the biosynthesis of the plant sterol cycloartenol and the pentacyclic lupeol were successfully implemented by heterologous expression of the respective genes of Arabidopsis thaliana. The heterologous expression had neither a negative effect on the growth nor the intrinsic carotenoid level of the host R. capsulatus. A comparative evaluation of diverse squalene and cycloartenol synthases derived from different organisms as well as the application of several metabolic engineering strategies on the host’s isoprenoid biosynthesis pathway, which provides C15 triterpene precursor farnesylpyrophosphate (FPP), resulted in remarkably case-specific effects. While squalene production was strongly dependent on the respective synthase, this did not hold true for the production of cycloartenol. Accordingly, the maximal squalene titer of 90.90 mg/L was reached by applying a squalene synthase from Methylococcus capsulatus and co-expression of the ispA encoded FPP-synthase and the maximum cycloartenol titer of 1.13 mg/L by applying the A. thaliana cycloartenol synthase in combination with an R. capsulatus strain possessing a deletion in its native FPP converting geranylgeranylpyrophosphate synthase. Altogether, the necessity of an individual calibration for the purpose of optimizing product levels of the heterologous terpene biosynthesis in R. capsulatus became apparent. Moreover, for the A. thaliana lupeol synthase as well as for one of the two applied myxobacterial cycloartenol synthases the formation of an additional triterpene product was detected in detailed mass spectrometry analyses. The measurements led to the assumption, that those additional products are oxygenated derivatives of the compounds lupeol and cycloartenol, respectively. In conclusion, the phototrophic bacterium R. capsulatus was established as an expression host for the heterologous production of triterpenes and for the characterisation of relevant enzymes for this purpose. Collectively, two microbiological and biotechnological approaches for the exploitation of combinatorial antibacterial secondary metabolites were demonstrated within the scope of the present thesis.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	23.11.2021
Dateien geändert am:	23.11.2021
Promotionsantrag am:	10.12.2020
Datum der Promotion:	12.05.2021