Dokument: Verstehen des Mechanismus der SOS1- Interaktionen und der Aktivierung in Richtung RAS GTPases
| Titel: | Verstehen des Mechanismus der SOS1- Interaktionen und der Aktivierung in Richtung RAS GTPases | |||||||
| Weiterer Titel: | Understanding the mechanism of SOS1 interactions and activation towards RAS GTPases | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=57672 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20221013-094347-9 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr Kazemeinjasemi, Nedasadat [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Reza Ahmadian [Betreuer/Doktorvater] George Groth [Betreuer/Doktorvater] | |||||||
| Stichwörter: | SOS1, GRB2, RAS MAPK, Cancer | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die RAS-Superfamilie ist eine große Gruppe von GTP-bindenden Proteinen, die eine gemeinsame konservierte G-Domäne teilen. Sie wird in fünf Familien unterteilt, darunter RHO, RAS, RAB, ARF und RAN. Die RAS-Signaltransduktion wird über die physikalische Interaktion mit den zwei Regulator Familien, GEFs (Guanin-Nukleotid- Austauschfaktoren) und GAPs (GTPase-aktivierende Proteine), und einer großen Anzahl von nachgeschalteten Effektoren vermittelt. GEFs beschleunigen die RAS- Aktivierungsreaktion über GDP/GTP-Austausch und GAPs erhöhen die Rate der GTP- Hydrolyse Reaktion. Unter allen RAS-GEFs im menschlichen Genom ist SOS1 der am besten untersuchte RAS-Aktivator. SOS1 existiert in einer autoinhibierten Struktur im Zytoplasma, aufgrund von Inter-Domänen Interaktionen. SOS1 Aktivierung erfolgt durch die Rekrutierung an die Plasmamembran über das Adaptorprotein GRB2. Diese Interaktion erfolgt über die SH3-Domänen von GRB2 mit der Prolin-reichen Domäne von SOS1. Obwohl die SOS1-GRB2-Interaktion der kritische Schritt in der SOS1-Aktivierung ist, ist der biochemische Mechanismus der Interaktion noch nicht gut verstanden. Hier haben wir die SOS1-GRB2-Interaktion unter die Lupe genommen und eine allosterische Regulation der GRB2-SOS1-Interaktion vorgeschlagen, die durch die GRB2-Interaktion mit dem aktivierten Rezeptor an der Plasmamembran gesteuert wird. GRB2 ist nicht das einzige SH3-haltige Protein, das mit SOS1 interagiert. SOS1 umfasst mehr als 10 Prolin- reiche Motive. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass es weitere SH3-haltige Proteine geben muss, die mit SOS1 interagieren und es regulieren. Die Charakterisierung der Interaktion von SH3-Domänen im menschlichen Genom mit den Prolin-reichen Motiven von SOS1 bestätigte die Interaktion von nicht nur bereits berichteten, sondern auch neuen Bindungspartner von SOS1, darunter SPD2A, ARHGAP12, OBSCN, RIMBP3 und SORBS1.
Der RHO-spezifische GDP-Dissoziationsinhibitor 1 (GDI1), ein anderer Typ eines kleinen GTPase-Regulators, bindet an isoprenylierte RHO-GTPasen und extrahiert sie aus der Membran. Der Mechanismus und die strukturelle Spezifität von GDI1 blieben unklar. Diese Studie lieferte neue mechanistische Details über die Funktion von GDI1 gegenüber RHO GTPasen, insbesondere RAC1. Demnach unterliegt die Membranextraktion von RHO GTPasen durch GDI einem 3-Schritt-Mechanismus: (1) Eine unspezifische Assoziation von GDI mit der „Switch region“ der RHO-GTPasen; (2) ein elektrostatischer Schalter, der die Interaktionsspezifität zwischen der C-terminalen polybasischen Region der RHO-GTPasen und zwei unterschiedlichen negativ geladenen Regionen von GDI1 bestimmt; (3) eine unspezifische Verdrängung der Geranylgeranyl-Einheit von der Membran und ihre Sequestrierung in einen hydrophoben Spalt, der sie effektiv vom wässrigen Milieu abschirmt. Diese Studie stellt das Paradigma der RAC1-Regulation durch GDI1 eindeutig in Frage. Neben dem Verständnis der GDI- Interaktion identifizierten und charakterisierten wir den ersten niedermolekularen RHO- GDI1-Inhibitor als Pseudo-Naturprodukt (NP) mit dem Namen Rhonin. Unsere Daten zeigten, dass Rhonin die Bindung von GDI1 an RHO GTPasen hemmt und somit auch die Signaltransduktion über den nicht-kanonischen Hedgehog-Signalweg hemmt. 5 Aktive, GTP-gebundene RAS-Proteine interagieren selektiv mit nachgeschalteten Effektoren und leiten Signale über mehrere Signalwege weiter, um verschiedene zelluläre Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose zu steuern. RAS- Effektoren sind hauptsächlich RAS-Assoziations- (RA) oder RAS-Bindungsdomäne (RB) enthaltende Proteine. Hier untersuchten wir eingehend die Spezifität der Interaktion verschiedener RAS-Proteine mit der RA-Domänen-Familie, die sogenannten RASSFs. Wir fanden neuartige Interaktionen zwischen RRAS1, RIT1 und RALA und RASSF7, RASSF9 bzw. RASSF1, die systematisch in ihrer Sequenz, Struktur und Bindung untersucht und durch Mutationsanalysen validiert wurden. Diese Daten lieferten eine Reihe von unterschiedlichen funktionellen Eigenschaften und mutmaßlichen biologischen Rollen, die nun im zellulären Kontext untersucht werden sollten. Mutationen in RAS-Genen wurden nicht nur bei Krebserkrankungen, sondern auch bei Entwicklungsstörungen, einschließlich des Noonan-Syndroms (NS), gefunden. Wir konnten zeigen, dass die NS-verursachenden Mutationen in den RRAS2-Varianten hochkonservierte Aminosäuren betreffen, die um die Nukleotid-Bindungstasche der GTPase herum lokalisiert sind. Es wurde vorhergesagt, dass sie verschiedene Aspekte des biochemischen Verhaltens von RRAS2 beeinflussen, einschließlich der Nukleotidbindung, der GTP-Hydrolyse und der Interaktion mit Effektoren. Zusätzlich erhöhen alle pathogenen Varianten die Aktivierung der MAPK-Kaskade und wirken sich unterschiedlich auf die Zellmorphologie und die Reorganisation des Zytoskeletts aus.The RAS superfamily is a large group of GTP binding proteins, which share a common conserved G domain. They are divided into five families, including RHO, RAS, RAB, ARF, and RAN. RAS signalling is mediated via their physical interaction with two regulator families, GEFs (Guanine nucleotide exchange factors) and GAPs (GTPase activating proteins), and a large number of downstream effectors. GEFs accelerate the RAS activation reaction via GDP/GTP exchange and GAPs increase the rate of GTP hydrolysis reaction. Among all RAS GEFs in the human genome, SOS1 is the best studied RAS activator. SOS1 exists in an auto-inhibited structure in the cytoplasm due to the inter-domain interactions. Its activation takes place through its recruitment to the plasma membrane via GRB2 adaptor protein. This interaction occurs via SH3 domains of GRB2 with the proline-rich domain of SOS1. Although SOS1-GRB2 interaction is the critical step in SOS1 activation, still the biochemical mechanism of the interaction is not well understood. Here, we shed light on the SOS1-GRB2 interaction and proposed an allosteric regulation of GRB2-SOS1 interaction that is controlled by GRB2 interaction with the activated receptor at the plasma membrane. GRB2 is not the only SH3- containing protein that interacts with SOS1. SOS1 comprises more than 10 proline-rich motifs. Thus, we hypothesized that there must be other SH3-containing proteins that interact with and regulate SOS1. Therefore, we characterized the interaction of SH3 domains in the human genome with proline-rich motifs of SOS1. We proved the interaction of already reported SOS1 binding partners by clarifying the exact binding sites and also introduced new binding partners of SOS1 including SPD2A, ARHGAP12, OBSCN, RIMBP3, and SORBS1. RHO-specific GDP-dissociation inhibitor 1 (GDI1), a different type of small GTPase regulator, binds to isoprenylated RHO GTPases and extracts them from the membrane. The mechanism and structural specificity of GDI1 remained unclear. This study provided unprecedented mechanistic details about the GDI1 function towards RHO GTPases, especially RAC1. Accordingly, membrane release of RHO GTPases by GDI1 underlies a 3-step mechanism: (1) A non-specific association of GDI with switch regions of the RHO GTPases; (2) an electrostatic switch determining the interaction specificity between the C-terminal polybasic region of RHO GTPases and two distinct negatively charged clusters of GDI1; (3) a non-specific displacement of geranylgeranyl moiety from the membrane and its sequestration into a hydrophobic cleft, effectively shielding it from the aqueous milieu. This study unambiguously challenges the paradigm of RAC1 regulation by GDI1. Besides understanding the GDI interaction, we identified and characterized the first small molecule RHO GDI1 inhibitor as a pseudo-natural product (NP) termed Rhonin. Our data revealed that Rhonin inhibits binding of the GDI1 to RHO GTPases and consequently inhibits signal transduction through a non-canonical Hedgehog pathway. Active, GTP-bound RAS proteins selectively interact with downstream effectors and transmit signals towards multiple pathways to control diverse cellular processes, such as proliferation, differentiation and apoptosis. RAS effectors mainly are RAS association (RA) or RAS binding (RB) domain-containing proteins. Here, we investigated in-depth the specificity of the interaction of different RAS proteins with the RA domain family, called RASSFs. We found novel interactions between RRAS1, RIT1, and RALA and RASSF7, RASSF9, and RASSF1, respectively, which were systematically explored in sequence-structure-property relationship analysis, and validated by mutational analysis. These data provided a set of distinct functional properties and putative biological roles that should now be investigated in the cellular context. Mutations in RAS genes were not only found in cancers but also developmental disorders, including Noonan syndrome 4 (NS). We showed that the NS-causing RRAS2 variants affect highly conserved residues localized around the nucleotide binding pocket of the GTPase and are predicted to variably affect diverse aspects of RRAS2 biochemical behaviour, including nucleotide binding, GTP hydrolysis, and interaction with the effectors. Additionally, all pathogenic variants increase activation of the MAPK cascade and variably impact cell morphology and cytoskeletal rearrangement. | |||||||
| Rechtliche Vermerke: | I would like to prohibit the thesis publication for one year because it contains unpublished data. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Bezug: | 1 year | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 13.10.2022 | |||||||
| Dateien geändert am: | 13.10.2022 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 21.04.2021 | |||||||
| Datum der Promotion: | 17.08.2021 |
