Dokument: Towards a competitive expression platform Strategies to optimize unconventional protein secretion in Ustilago maydis

Titel:	Towards a competitive expression platform Strategies to optimize unconventional protein secretion in Ustilago maydis
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=57600
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20211004-105405-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hußnätter, Kai Philip [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 35,83 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 04.10.2021 / geändert 04.10.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Feldbrügge, Michael [Gutachter] Prof. Dr. Zurbriggen, Matias [Gutachter]
Stichwörter:	Secretion, Ustilago maydis, Protein expression, Microbiology, Biotechnology
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die biotechnologische Produktion und Sekretion heterologer Proteine stellt hohe Anforderungen an die jeweiligen Expressionssysteme. Eine breite Auswahl an Sekretionssystemen ist daher wichtig, um vorhandene Nischen zu füllen. Die Anwendung der unkonventionellen Sekretion für den Export heterologer Proteine im neuartigen biotechnologischen Produktionswirt U. maydis wurde bereits in früheren Studien etabliert. Die Nutzung der endogenen sekretorischen Maschinerie der Chitinase Cts1 über einen alternativen Exportweg, ermöglicht die Sekretion von unglykosylierten Proteinen. Dies kann unter anderem zur Sekretion von pharmazeutisch relevanten oder bakteriellen Proteinen von Vorteil sein. Im Zuge dieser Dissertation wurden zwei Hauptstrategien verfolgt, um das System in Bezug auf Anwendbarkeit und Ausbeute weiter zu optimieren. i) Einblicke in den Mechanismus der unkonventionellen Sekretion zeigten deren Abhängigkeit von der Bildung des sekundären Septums während der Zytokinese auf. Dieses schließt die funktionelle Fragmentierungszone zwischen Mutter- und Tochterzelle ab. Die Bildung des sekundären Septums ist abhängig von der Kinase Don3, welche dadurch als Gatekeeper dieses Mechanismus fungiert. Folglich führt eine Deletion von don3 zu einer starken Minderung der unkonventionellen Sekretion. Die Identifizierung der regulatorischen Komponenten für die unkonventionelle Sekretion erlaubte die Anwendung zur Regulation dieses Prozesses. Hierzu wurde im Rahmen dieses Projekts die Regulation von Don3 sowohl auf transkriptioneller als auch auf post-translationaler Ebene etabliert. Während die transkriptionelle Regulation auf einem Kohlenstoffquellen-induzierbaren Promotor basiert, wurde die post-translationale Regulation durch eine alternative, ATP-Analog empfindliche, Don3 Version erreicht. Optimierungen der Kultivierung sowie Regulationsbedingungen ermöglichten die effiziente Anwendung beider Systeme zur Proteinproduktion und –sekretion. Die Etablierung eines Autoinduktionsprozesses erlaubte die Kultivierung in Batch-Fermentation mit getrennten Phasen der Proteinsynthese sowie Sekretion. Der Prozess der autoinduzierbaren Sekretion wurde mittels Nachweises des Exportes von funktionellen Nanobodies verifiziert und zeigte das Potential dieses Systems. ii) Durch Anwendung eines vorwärts-genetischen Screens wurde der neuartige Sekretionsfaktor Jps1 als essentiell für die unkonventionelle Sekretion von Cts1 identifiziert. Im Rahmen dieser Arbeit führte die Anpassung dieses genetischen Screens zur Identifizierung von Hypersekretionsmutanten. Wichtige Erkenntnisse zur Aufdeckung der zugrundeliegenden Mutationen mittels pooled linkage analysis zeigten Möglichkeiten und Grenzen dieser Strategie auf und werden als Grundlage für weitere Optimierungen zur effizienten Analyse von Hypersekretionsmutanten und –mutationen dienen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ausbeute und Anwendbarkeit der unkonventionellen Sekretion heterologer Proteine maßgeblich verbessert werden konnte. Dies ist ein wichtiger Schritt in Richtung einer wettbewerbsfähigen, biotechnologischen Expressionsplattform. Biotechnological production and secretion of heterologous proteins puts high demands on chassis and production conditions. A broad selection of production hosts is important to fill existing niches. Application of unconventional secretion for export of heterologous proteins in the novel biotechnological production candidate U. maydis was established in previous studies. Hitchhiking of the endogenous secretory machinery of chitinase Cts1 via an alternative export route allows secretion of unglycosylated proteins, which can be advantageous for example for distinct pharmaceutical or bacterial targets. In the present study two major strategies were followed to further optimize the system in terms of applicability and yield. i) Mechanistic insights revealed a connection of unconventional secretion and formation of the secondary septum during cytokinesis, sealing the functional fragmentation zone between mother and daughter cell. Formation of the secondary septum is dependent on the kinase Don3. With its essential role for formation of a functional fragmentation zone, it acts as a gatekeeper for Cts1 secretion. Thus, deletion of don3 strongly diminishes unconventional secretion. Identification of regulatory components for unconventional secretion allows exploitation towards regulation of this process. To this end, regulation of Don3 was established in the present work on both, transcriptional and post-translational level. While transcriptional regulation is based on a carbon source inducible promoter, post-translational regulation was achieved by an alternative version of Don3, sensitive to an ATP-analogue. Optimization of cultivation and regulation conditions allowed efficient application of either system for protein production. Establishment of an autoinduction process enabled cultivation in batch fermentation with separated protein synthesis and secretion phases. Proof of principle experiments on export of functional nanobodies demonstrated the potential of inducible secretion. ii) Application of a forward genetic screen revealed the novel secretion factor Jps1 as essential for unconventional secretion Cts1. In the present study, adaptation of this genetic screen for identification of hyper secretion mutations led to isolation of at least four hyper secretion candidates. Important insights for elucidation of the underlying mutation via pooled linkage analysis demonstrated capability and limitations of this system and will direct further optimizations for efficient analysis of hyper secretion mutants and responsible mutations. In summary, yield and applicability of unconventional secretion of heterologous proteins could be improved towards a more competitive biotechnological expression platform.
Quelle:	Detaillierte Quellenangaben sind der Arbeit zu entnehmen
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Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Bezug:	Januar 2017 - Juni 2021
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	04.10.2021
Dateien geändert am:	04.10.2021
Promotionsantrag am:	24.06.2021
Datum der Promotion:	22.09.2021