Dokument: Oxidoreduktasen: Von neuen Biokatalysatoren bis zum fertigen Naturstoff

Titel:	Oxidoreduktasen: Von neuen Biokatalysatoren bis zum fertigen Naturstoff
Weiterer Titel:	Oxidoreductases: From novel biocatalysts up to a finished natural compound
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=57497
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20210929-094018-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	M. Sc. Dickmann, David [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 13,36 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 20.09.2021 / geändert 20.09.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Pietruszka, Jörg [Gutachter] Prof. Dr. Czekelius, Constantin [Gutachter]
Stichwörter:	Oxidoreduktasen, Laccasen, Monooxygenasen, Alkoholdehydrogenasen, Biokatalyse
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Nachdem von den Kooperationspartnern eine aufgereinigte Proteinprobe mit Laccaseaktivität im alkalischen Milieu und der dazugehörige Hostorganismus zur Verfügung gestellt wurde, gelang es sowohl den Organismus in unterschiedlichen Medien zu kultivieren als auch das Protein näher zu charakterisieren. Es wurde festgestellt, dass das sekretierte Protein stark glykosyliert vorliegt und eine erste Untersuchung mit MALDI-TOF erlaubte die Zuordnung zu einem verwandten Gen einer putativen Laccase aus R. solani AG-3 Rhs1AP. Der initiale Versuch diese putative Laccase heterolog in E. coli zu exprimieren schlug jedoch fehl. An dieser Stelle war jedoch nicht auszuschließen, dass die originale Laccase aus R. solani F 895 in E. coli exprimierbar ist. Daher wurden Anstrengungen unternommen die Originalsequenz der Laccase zu ermitteln. Da zusätzlich noch keinerlei genetische Information über den Wirtsorganismus vorlag, wurde beschlossen das gesamte Genom zu entschlüsseln, da die Genome und Transkriptome von R. solani-Stämmen große Unterschiede voneinander aufweisen können.[83] Die somit neu gewonnen Daten wären nicht redundant und besäßen auch außerhalb des Projektes eine hohe Relevanz für zukünftige biotechnologische Untersuchungen. Das Genom von R. solani F-895 wurde erfolgreich isoliert und sequenziert, woraufhin weitere MALDI-Peptide aus der ursprünglichen Analyse zugeordnet werden konnten. Zu diesem Zeitpunkt konnten die Intron- und Exon-Strukturen des Gens jedoch nur mit Hilfe von „in-silico“-Methoden vorhergesagt werden, weshalb das vollständige Gen noch nicht mit absoluter Sicherheit zugeordnet werden konnte. Zusätzlich fehlten Informationen über den N-Terminus des Gens, der noch nicht aufgeklärt werden konnte. Aus diesem Grund wurde zusätzlich auch das Transkriptom des Organismus untersucht. Dieses konnte in Folgeexperimenten ebenfalls isoliert und sequenziert werden. Die Sequenzdaten bestätigten die vorhergesagte Sequenz aus der Genomisolation und die weitere Untersuchung zeigte, dass das Ursprungsprotein mit hoher Wahrscheinlichkeit ein Sekretionssignal vor dem N-Terminus besitzt. Dieses Ergebnis deckt sich mit den beobachteten Laccaseaktivitäten in Kulturüberständen von R. solani F-895. Anhand der Gesamtdaten wurde ein neues synthetisches Gen, mit der Originalsequenz aus R. solani F-895, in E. coli BL21 (DE3), Rosetta (DE3) und Arctic Express (DE3) exprimiert. Es konnte jedoch in keinem der unterschiedlichen E. coli-Stämme lösliches und funktionales Protein nachgewiesen werden. In einem weiteren Versuch wurde das Protein mit einem Löslichkeitsvermittler, dem Maltosebindeprotein aus E. coli, fusioniert. Dieses Protein ist häufig in der Lage eine lösliche Expression, von zuvor unlöslich exprimierten Proteinen, zu ermöglichen.[123, 129] Auch dieser Versuch blieb jedoch erfolglos. Auf Grund der erfolglosen heterologen Expression der Laccase im prokaryotischen Organismus E. coli, wurde das Protein im eukaryotischen Organismus S. cerevisiae produziert. Dieser Organismus ist im Gegensatz zu E. coli in der Lage das Protein post-translational zu modifizieren. Da die Laccase vom Ursprungsorganismus sekretiert wird, wurde neben einer Variante ohne Sekretionssignal, eine weitere Variante mit einer N terminalen Sekretionssequenz aus S. cerevisiae versehen. Beide Varianten wurden in S. cerevisiae exprimiert und für die Variante mit Sekretionssignal konnte Laccaseaktivität im Überstand detektiert werden. Diese war zwar sehr gering, zeigte jedoch die gleiche pH-Abhängigkeit wie die Aktivität im Überstand des Ursprungsorganismus.[28] Es konnte keine Aktivität für die Variante ohne Sekretionssignal im Überstand festgestellt werden und keine Aktivität in den jeweiligen Zelllysaten beider Varianten. Um die scheinbar obligatorische Sekretion zu verbessern wurde versucht die Linkersequenz zwischen Sekretionssignal und Protein zu optimieren. Dies führte jedoch nicht wie gewünscht zu erhöhter Laccaseaktivität im Überstand. Um das Protein dennoch zu charakterisieren, wurde es zusätzlich mit einem C-terminalen Strep-Tag versehen, damit die Möglichkeit zur Aufreinigung des Proteins besteht. Der initiale Versuch das Enzym aufzureinigen blieb jedoch erfolglos. Dennoch konnten drei unterschiedliche Varianten des Enzyms erstmalig heterolog in S. cerevisiae exprimiert werden. Die höchsten erhaltenen Aktivitäten in den Kulturüberständen waren mit 20 U/L jedoch deutlich geringer als jene im Kulturüberstand des Ursprungsorganismus mit 218 U/mL. Es existiert nun zusätzlich eine Plattform für molekularbiologische Arbeiten zur Verbesserung der Laccaseproduktion und Sekretion. Die mögliche Anwendung des Proteins im Rahmen des ursprünglichen Projekts, zur Lignansynthese in E. coli, ist dagegen aufgrund der fehlenden Exprimierbarkeit in E. coli vorerst nicht durchführbar gewesen. Nachdem in vorangegangenen Arbeiten festgestellt wurde, dass P450 BM3 in der Lage ist den Homoallylalkohol Non-1-en-4-ol (11) in allylischer Position zu hydroxylieren, wurde die Reaktion näher untersucht und ein Eindruck von der Produktverteilung der regioisomeren Produkte gewonnen.[197] Der initiale Versuch, ein geeignetes chromatographisches Trennprogramm für die Vielzahl an Regio-, und Stereoisomeren zu finden, misslang. Um neben des bereits untersuchten Homoallylalkohols 11 eine breite Palette synthetisch interessanter Substrate untersuchen zu können, wurde beschlossen eine Screeningplattform für die Bildung vicinaler Diole, in P450 katalysierten Reaktionen, zu etablieren. Die Auswahl fiel auf ein bereits publizierten, vicinalen Diol-Nachweis mit Hilfe von Natriumperiodat und Adrenalin.[236] Es wurde getestet ob diese Art des Screenings auch auf das komplexe System einer P450 BM3 katalysierten Reaktion übertragbar ist. Dabei wurde festgestellt, dass der Nachweis von vicinalen Diolen auch innerhalb dieser komplexen Systeme möglich ist und in der allylischen Oxidation von Non 1 en 4 ol (11) im größeren Maßstab, ausreichende Mengen vicinales Diol generiert werden. Die Anwesenheit von Störfaktoren wie Glucose erforderte jedoch eine Extraktion der Reaktionsansätze, was zwar zu erhöhter Sensitivität des Diol-Nachweises führt, allerdings eine schwierige Handhabung des Screenings zur Folge hat. Der Nachweis von vicinalem Diol konnte ebenfalls in der Untersuchung von P450 BM3 Bibliotheken erfolgen. Auf Grund der schwierigen Handhabung waren diese Ergebnisse jedoch nicht reproduzierbar. Um die Handhabung des Screenings zu vereinfachen wurde das Cofaktor-Recycling System gewechselt, da die hohe Konzentration an Glucose die Extraktion der Proben vorher zwingend notwendig machte. Sowohl die Formiat-Dehydrogenase, als auch die Phosphit-Dehydrogenase wurden dafür erfolgreich eingesetzt. Die folgenden Reaktionsansätze mussten nicht mehr extrahiert werden, die anschließend fehlende Aufkonzentrierung führt jedoch auch zu einer geringeren Nachweisgrenze an vicinalem Diol. Eine solche Menge wurde unter Screeningbedingungen jedoch nicht zuverlässig in der biokatalytischen Umsetzung von Non 1 en 4 ol (11) erzeugt. Parallel zur Entwicklung des Screenings wurden 28 neue Mutanten vom Wildtyp und von P450 BM3 A74G L188Q erzeugt. Diese beiden Varianten wurden ausgewählt, da sie zuvor die größte Menge vicinales Diol in der Oxidation des Homoallyalkohols 11 erzeugten. Dafür wurden die hydrophoben Aminosäuren L75, L181 und I263 jeweils durch die Aminosäuren K, H, Q, N und T substituiert. Diese Aminosäuren sind an der Ausbildung einer hydrophoben Tasche des Enzyms beteiligt. Diese liegt auf der gegenüberliegenden Seite des Häms im aktiven Zentrum und spielt eine Rolle in der Ausrichtung hydrophober Substrate.[204] Der Austausch dieser hydrophoben Aminosäuren durch Aminosäuren mit polaren Substituenten könnte demnach eine Umorientierung von Substraten im aktiven Zentrum zur Folge haben und damit Hydroxylierungen in vicinaler Position zu bereits existierenden Hydroxygruppen oder Ketogruppen begünstigen. Eine Verschiebung des Produktspektrums hin zu vicinalen Diolen bzw. α-Hydroxyketonen wäre dadurch möglich. Die generierten Mutanten konnten jedoch noch nicht auf diesen Effekt hin getestet werden, da das Adrenalin basierte Screening noch keine verlässlichen Daten liefert. Im Rahmen des dritten Projektes wurden die Grenzen des Substratfensters der Alkohol-Dehydrogenase aus Thermoanaerobacter brockii für die kinetische Racematspaltung von aliphatischen, linearen Homoallylalkoholen ausgetestet. Dabei wurde festgestellt, dass die Alkoholdehydrogenase in der Lage ist die Seitenketten des beinahe symmetrischen Homoallylalkohols Hept-1-en-4-ol (26) zu unterscheiden und somit einen Baustein für die stereoselektive Synthese von Putaminoxin (37) bereitzustellen. Die Unterscheidung ist jedoch nicht so absolut wie für die längeren Homoallylalkohole Oct-1-en-4-ol (27) und Non-1-en-4-ol (11), was zu verringerten Enantiomerenüberschüssen bei 50 % Umsatz führt. Für die Oxidation von Kettenlängen >C-10 verlängert sich der Zeitraum bis zu einem Umsatz von 50 % erheblich, so dass die kinetische Racematspaltung mit Hilfe der ADH nur in einem beschränkten Fenster dieser Substrate sinnvoll ist. Nichtsdestotrotz konnten mit Hilfe des enantiomerenangereicherten Homoallylalkohols 26 die chemoenzymatische Synthese des phytotoxischen Naturstoffs Putaminoxin (37) erfolgen. Da in vorangegangenen Publikationen Unregelmäßigkeiten im 13C NMR der Stereoisomere von verwandten Nonenoliden festgestellt wurden, wurden sowohl das (5S,6E,9R)-Stereoisomer [(5S,6E,9R)-37] als auch das (5S,6E,9S)-Stereoisomer [(5S,6E,9S)-37] synthetisiert.[285] Die anschließende Untersuchung der neu erhobenen NMR-Daten bestätigte das Bild der zuvor gemachten Beobachtungen von Bisterfeld und Holec et al.[285] Die Daten waren nicht konsistent mit denen vorheriger Synthesen von Putaminoxin (37), welches (5S,6E,9R)-konfiguriert sein soll. Anhand der NMR-Daten, der spezifischen Drehwerte und dem Abgleich dieser Werte mit den Daten anderer (5S,6E,9R)- und (5S,6E,9S)-, bzw. (5R,6E,9R)-konfigurierter Nonenolide, wurde ein neuer Strukturvorschlag für das ursprünglich isolierte, phytotoxische Macrolacton erstellt. Dieser sieht eine (5R,6E,9R)-Konfiguration vor, da diese alle Unterschiede in den Daten erklären würde. The cooperation partners of the BioLiSy-project from Russia provided a purified laccase sample and its original host R. solani VKM F-895. The purified laccase-sample was deglycosylated and analysed via SDS-gelelectrophoresis. In addition, a MALDI-TOF analysis was performed. The investigation via gelelectrophoresis showed that the secreted protein is heavily glycosylated by its host organism. It showed a molecular weight of ~80 kDa in its glycosylated form and a molecular weight of 60 kDa in its unglycosylated form. The MALDI-TOF analysis revealed four peptides which align to the sequence of a putative Laccase from another R. solani strain, the strain AG 3 Rhs1Ap. A synthetic gene of the putative laccase was expressed in E. coli, but no sign of laccase production or activity could be detected. To rule out that the failed expression of the putative laccase from R. solani AG-3 Rhs1Ap is indicative of a failed expression of the laccase of interest from R. solani VKM F-895, investigations towards the original laccase sequence were undertaken. Since there exists no sequence information for R. solani F-895, the fungus was cultivated and the genomic DNA isolated. The whole genome was sequenced, and the introns and exons predicted with “in-silico” methods. A comparison of the new DNA-sequence and the former MALDI-TOF analysis revealed two more peptides which could not be assigned to the laccase before, since they are specific for the laccase from R. solani F-895. Additionally, a stop codon was found in the N-terminal region of the protein, revealing the fact, that the laccase from R. solani F-895 is shorter. After the analysis of the genomic DNA, the organism was cultivated again, and the RNA was isolated to reveal the transcriptome and the mature sequence of the laccase. In addition to the intron-free sequence of the laccase a host-specific signal peptide was identified. The new laccase without its signal peptide was expressed in E. coli BL21 (DE3), Rosetta (DE3) and Arctic Express (DE3) but no soluble and active laccase could be obtained. Therefore, the laccase was fused to a known solubility-tag, the MalE-protein from E. coli. Despite the solubility tag, no soluble or active laccase could be obtained in E. coli. Since the expression of the fungal ligninolytic enzyme was unsuccessful in the prokaryotic organism, the expression organism was changed to the eukaryotic organism S. cerevisiae. The eukaryotic organism can perform the probably mandatory post-translational transformations of the laccase. Since the laccase is secreted in the fungus, two different variants were expressed in S. cerevisiae. The first variant was the laccase without a signal peptide, while the second was fused to the signal peptide of the mating factor alpha pheromone of S. cerevisiae. A low amount of laccase activity could be detected in the culture medium of the second variant, while no activity could be detected in the culture medium of the first variant. No laccase activity was observed in the cell lysate of both variants. The pH-dependant activity pattern towards ABTS (8) and 2,6-DMP (9) resembled the activity pattern of the originally secreted ligninolytic protein from R. solani F-895. Since the secretion of the enzyme seems to be mandatory, efforts were undertaken to increase the amount of secreted protein in S. cerevisiae. To achieve a higher amount of secreted laccase the linker-sequence between the signal peptide and the protein was optimized. Despite the effort no increased activity could be detected in the culture medium afterwards. To further analyze the laccase and measure the amount of secreted protein a C-terminal affinity tag was fused to the laccase. Initial efforts to purify the protein were not successful though. Despite these failed efforts, all three different variants of the laccase could be heterologously expressed in S. cerevisiae for the first time, leading to laccase activities of 15-20 U/L in the culture medium after 48 hours. This is severely lower than the reported 218 U/mL in the culture medium of the fungus after three days.[28] In addition a platform for further improvements of laccase production and secretion in S. cerevisiae was established. Due to the insoluble and inactive expression in the prokaryote E. coli an application in the BioLiSy-project was not yet possible. Previously carried out experiments showed that P450 BM3 GQ variant can hydroxylate the non-natural substrate non-1-en-4-ol (11) in allylic position with a preference for the syn-configured vicinal diol.[197] Further experiments were conducted to gain an impression of the distribution of generated regioisomers. To quantify the different products a separation of the different regio- and stereoisomers via gas-chromatography was tested, but not successful. To open the possibility of investigating more potential substrates than just the homoallylic alcohol 11, the establishment of a screening-method for the generation of vicinal diol products with P450 BM3 was attempted. An already published screening-method for the detection of diol-products in cofactor-independent enzyme catalyzed reactions was chosen as a starting point. This screening utilizes sodium periodate and adrenaline to photometrically detect vicinal diols.[235, 236] It was shown that enough vicinal diol was produced in the P450 BM3 catalyzed oxidation of 11 in bigger scales, to detect it with the adrenaline-assay. The presence of high concentrations of glucose and other disruptive factors demanded an extraction of the reaction mixture though. The extraction and concentration of the extract led to lower detection limits of the product on the one-hand, but significantly increased the difficulty of sample handling on the other hand. Even though the generation of vicinal diol products in the oxidation of 11 with different variants of P450 BM3 could be verified, the difficult sample-handling did not allow to reproduce these results. Therefore, alternative cofactor-recycling systems were tested which allow for the direct measurement of the samples, without a previous extraction-step. A formiate dehydrogenase and a phosphite dehydrogenase were successfully employed in the cofactor recycling and vicinal diols could be directly detected without previous extraction of the reaction mixture. The absence of an extraction- and concentration-step lowered the detection limit though. This limit was not reliably reached in the oxidation of 11 with P450 BM3. Parallel to the development of the screening, 28 new mutants of the wildtype of P450 BM3 and P450 BM3 GQ were successfully generated. The wildtype and P450 BM3 GQ were chosen, because they previously produced the highest amounts of vicinal diol in the oxidation of the homoallylic alcohol 11. The hydrophobic amino acids L75, L181 and I263 were substituted with the amino acids K, H, Q, N and T. L75, L181 and I263 are part of the hydrophobic pocket in the active center of P450 BM3 and play a key-role in the orientation of substrates.[204] The substitution of these hydrophobic amino acids might therefore lead to a reorientation of substrates and allow for the preferred hydroxylation in vicinal position of alcohols and ketones. These newly generated variants could not be tested yet, since the adrenalin-assay did not yield reliable results yet. In the third project of this work the alcohol dehydrogenase from Thermoanaerobacter brockii was tested for its limits in the kinetic resolution of aliphatic, linear homoallylic alcohols with chainlengths from C 7 to C 12. It was shown that the dehydrogenase is capable of distinguishing between the side chains of the nearly symmetrical substrate Hept-1-en-4-ol (26) and therefore providing a building block for the chemoenzymatic synthesis of the phytotoxic nonenolide Putaminoxin (37). The distinction is not as good as for the longer aliphatic homoallylic alcohols like Oct-1-en-4-ol (27) and Non-1-en-4-ol (11) leading to a decreased enantiomeric excess at 50 % conversion. The oxidation of longer aliphatic homoallylic alcohols with chainlengths of >C-10 took much longer, making the kinetic resolution only feasible for the shorter chain homoallylic alcohols. Nevertheless, the chemoenzymatic synthesis of putaminoxin (37) could be completed employing the enantioenriched homoallylic alcohol 26. Since a previous publication revealed inconsistencies in the 13C NMR data of isolated and synthesized nonenolides, both (5S,6E,9R)-37 and its (5S,6E,9S)-37 diastereomer were synthesized.[285] The following analysis of the 13C NMR data confirmed the inconsistencies observed by Bisterfeld and Holec et al.[285] The newly aquired 13C NMR data of (5S,6E,9R)-37 did not fit the previous data of putaminoxin (37), which is reportedly (5S,6E,9R)-configurated as well. After a comprehensive comparison of the NMR data and the specific rotatory values of isolated and synthesized (5S,6E,9R)-, (5S,6E,9S)- and (5R,6E,9R)-configurated nonenolides, a different configuration of putaminoxin (37) is proposed. According to the data a (5R,6E,9R)-configuration for putaminoxin (37) can explain the observed differences between the different nonenolides and is therefore suggested.
Quellen:	[83] D. Wibberg, L. Andersson, G. Tzelepis, O. Rupp, J. Blom, L. Jelonek, A. Pühler, J. Fogelqvist, M. Varrelmann, A. Schlüter, C. Dixelius, BMC Genomics 2016, 17, 245; 'Genome analysis of the sugar beet pathogen Rhizoctonia solani AG2-2IIIB revealed high numbers in secreted proteins and cell wall degrading enzymes'. [123] R. B. Kapust, D. S. Waugh, Protein Sci. 1999, 8, 1668-1674; 'Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused'. [129] P. Riggs, Mol. Biotechnol. 2000, 15, 51-63; 'Expression and purification of recombinant proteins by fusion to maltose-binding protein'. [28] M. Kolomytseva, N. Myasoedova, A. Samoilova, E. Podieiablonskaia, A. Chernykh, T. Classen, J. Pietruszka, L. Golovleva, Process Biochem. 2017, 62, 174-183; 'Rapid identification of fungal laccases/oxidases with different pH-optimum'. [236] V. S. Fluxa, D. Wahler, J.-L. Reymond, Nat. Protocols 2008, 3, 1270-1277; 'Enzyme assay and activity fingerprinting of hydrolases with the red-chromogenic adrenaline test'. [204] K. G. Ravichandran, S. S. Boddupalli, C. Hasermann, J. A. Peterson, J. Deisenhofer, Science 1993, 261, 731-736; 'Crystal structure of hemoprotein domain of P450BM-3, a prototype for microsomal P450's'. [285] C. Bisterfeld, C. Holec, D. Böse, P. Marx, J. Pietruszka, J. Nat. Prod. 2017, 80, 1563-1574; 'Chemoenzymatic Total Synthesis of the Proposed Structures of Putaminoxins B and D'. [197] D. Dickmann, Master thesis, Heinrich-Heine Universität Düsseldorf 2015, Auf dem Weg zur Pinellinsäure: Ein chemoenzymatischer Ansatz.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Bioorganische Chemie
Dokument erstellt am:	29.09.2021
Dateien geändert am:	29.09.2021
Promotionsantrag am:	23.04.2020
Datum der Promotion:	30.09.2020