Dokument: Optimierung der Amplifikation des kompletten HIV-1 pol-Gens zur Untersuchung der Koevolution von Resistenzmutationen innerhalb einer HIV Quasispezies
| Titel: | Optimierung der Amplifikation des kompletten HIV-1 pol-Gens zur Untersuchung der Koevolution von Resistenzmutationen innerhalb einer HIV Quasispezies | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=57401 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20210914-110156-2 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Frese, Robin Michael [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Jörg Timm [Gutachter] Prof. Dr.med. Dr.rer.pol. Caspers, Svenja [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | HIV, HIV-1, pol-Gen, Resistenzmutationen, antiretrovirale Therapie, Virologie, NGS | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Die derzeitigen Leitlinien zur antiretroviralen Therapie von HIV Patienten emp-fehlen die Integrase-Inhibitoren als potente Kombinationspartner mit einer brei-ten Wirksamkeit gegen multiresistente HIV-Stämme. Daher gewinnt die Analy-se von Resistenzen gegen Integrase-Inhibitoren an besonderer Bedeutung. Von großem Interesse ist dabei auch die Anwendbarkeit von ultratiefen Se-quenzierverfahren wie dem Next-Generation Sequencing (NGS), zur Untersu-chung von Resistenzprofilen. Die gemeinsame Amplifikation von Protease und reverser Transkriptase im pol-Gen ist derzeit etabliert, wohingegen die 3'-Integrase-Region separat sequenziert und analysiert wird. Das Ziel dieser Ar-beit war die Entwicklung einer neuen und stabilen subtypunabhängigen All-in-one PCR der kompletten HIV-1 pol-Genregion, um eine Analyse der Koexis-tenz von Resistenzmutationen in den verschiedenen Genregionen zu ermög-lichen. Das weitere Ziel der Arbeit bestand darin, den Vergleich von NGS und Klon-basierter Sequenzierung (CBS) zur Analyse der Heterogenität der arz-neimittelresistenten HIV-1 Quasispezies durchzuführen. Die All-in-one pol-PCR wurde unter Verwendung von Zellkulturüberständen und HIV-1-Plasmaproben aus der RESINA-Kohorte erstellt. Um das pol-Gen subtypenun-abhängig zu amplifizieren, wurde ein neues PCR-Protokoll etabliert, welches aus einer einstufigen RT-PCR mit RNA-Präinkubation mit T4gp32 und an-schließender Nested-PCR besteht. Dieses ermöglichte sowohl die Amplifikati-on des pol-Gens verschiedener HIV-1 Subtypen, als auch die Amplifikation bei niedrigeren HIV Viruslasten. Der Vergleich von NGS und CBS wurde retro-spektiv mit pol-Fragmenten von zehn multiresistenten HIV-1 Subtyp B Stäm-men durchgeführt, die durch routinemäßige Resistenzdiagnostik im Rahmen der RESINA Studie nachgewiesen wurden. Die Klonierung wurde durch iso-thermalen Zusammenbau nach Gibson mit anschließender klassischer San-ger Sequenzierung der pol-Klone durchgeführt. NGS der pol-PCR-Produkte erfolgte mittels Illumina MiSeq-Technologie. Die Resistenzprofile aller pol-Klone der zehn Patientenproben zeigten eine signifikante Korrelation der de-tektierten Resistenzmutationen durch CBS und NGS. Damit konnte gezeigt werden, dass NGS nicht nur eine hohe Sensitivität zum Nachweis von Resis-tenzen liefert, sondern auch die Heterogenität der HIV-1 pol-Quasispezies wi-derspiegelt. Das optimierte All-in-one pol PCR-Protokoll stellt einen neu entwi-ckelten HIV-1 Resistenztest dar, der es ermöglicht, in der klinischen Routine eine subtypenunabhängige Resistenzanalyse aller klinisch relevanten viralen Enzyme durchzuführen. Die zusätzliche Nutzung von ultratiefen Sequenzier-verfahren ermöglicht zudem den Nachweis von minoren resistenten Varianten innerhalb der HIV-Quasispezies.The current guidelines for antiretroviral therapy of HIV patients recommend integrase inhibitors as potent combination partners with broad efficacy against multidrug-resistant HIV strains. Therefore, the analysis of resistances against integrase inhibitors gains special importance. The applicability of ultra-deep sequencing methods such as Next-Generation Sequencing (NGS) for the analysis of resistance profiles is also of great interest. The joint amplification of protease and reverse transcriptase in the pol gene is currently established, whereas the 3' integrase region is sequenced and analysed separately. The aim of this work was the development of a new and stable subtype-independent all-in-one PCR of the complete HIV-1 pol gene region to enable the coanalysis of resistance mutations in the different gene regions. The fur-ther aim of the work was to compare NGS and clone-based sequencing (CBS) to analyse the heterogeneity of the drug-resistant HIV-1 quasispecies. All-in-one pol PCR was performed using cell culture supernatants and HIV-1 plasma samples from the RESINA cohort. To amplify the pol gene subtype-independently, a new PCR protocol was established, consisting of a one-step RT-PCR with RNA preincubation with T4gp32 and subsequent nested PCR. This enabled the amplification of the pol gene of different HIV-1 subtypes as well as at lower HIV virus loads. The comparison of NGS and CBS was per-formed retrospectively with pol fragments of ten multi-resistant HIV-1 subtype B strains detected by routine resistance diagnostics in the RESINA study. Clon-ing was performed by Gibson assembly followed by classical Sanger sequenc-ing of the pol clones. NGS of the pol PCR products was performed using Illu-mina MiSeq technology. The resistance profiles of all pol clones of the ten pa-tient samples showed a significant correlation of detected resistance mutations by CBS and NGS. Thus, it could be shown that NGS not only provides a high sensitivity for the detection of resistance but also reflects the heterogeneity of the HIV-1 pol quasispecies. The optimized all-in-one pol PCR protocol repre-sents a newly developed HIV-1 resistance test, which enables a subtype-independent resistance analysis of all clinically relevant viral enzymes in clini-cal routine. The additional use of ultra-deep sequencing techniques also al-lows the detection of minor resistant variants within the HIV quasispecies. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Bezug: | 2017-2021 | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 14.09.2021 | |||||||
| Dateien geändert am: | 14.09.2021 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 25.02.2021 | |||||||
| Datum der Promotion: | 09.09.2021 |
