Dokument: Etablierung eines siRNA-basierten Systems zur Untersuchung von verschiedenen an der Aortenklappendegeneration beteiligten Genen
| Titel: | Etablierung eines siRNA-basierten Systems zur Untersuchung von verschiedenen an der Aortenklappendegeneration beteiligten Genen | |||||||
| Weiterer Titel: | Establishment of a siRNA-mediated system allowing the investigation of several genes involved in the pathomechanisms of degenerative aortic valve disease | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=57379 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20210927-113236-2 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Blume, Britta [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Lichtenberg, Artur [Gutachter] Prof. Dr. Elvers, Margitta [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | DAVD, Etablierung, Gen-knockdown, siRNA | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Die degenerative Aortenklappenerkrankung (degenerative aortic valve disease, DAVD) ist eine der häufigsten kardiovaskulären Diagnosen. Die valvulären Interstitialzellen (VICs) sowie einige Kom-ponenten der valvulären Extrazellularmatrix scheinen bei den pathologischen Veränderungen der nativen Klappenstruktur im Rahmen der DAVD eine entscheidende Rolle zu spielen. Im besonderen Fokus stehen vier Moleküle: das Proteoglykan Biglykan (BGN), das Glykoprotein Osteopontin (OPN) sowie die membranständigen Enzyme Hyaluronsäure-Synthase-2 (HAS2) und Ekto-5´-Nukleotidase (CD73). Während man BGN und OPN pro-degenerative Eigenschaften zuschreibt, scheinen HAS2 und CD73 einen protektiven Effekt in Bezug auf Kalzifizierungsprozesse auszuüben. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Etablierung eines siRNA-basierten Systems, das in o-vinen VICs zu einer suffizienten Herunterregulierung der vier o. g. Gene auf Nukleinsäure-Ebene führt. Dieser sog. experimentelle Gen-knockdown beruht auf dem Prinzip der RNA-Interferenz (RNAi), bei der spezifische small interfering RNA-(siRNA-)Moleküle einen Abbau der komplementä-ren Ziel-mRNA und eine Hemmung der entsprechenden Genexpression vermitteln.
Methodisch wurden dazu ovine VICs aus den Aortenklappen von Schafen isoliert und im Rahmen der siRNA-Transfektion mit synthetischen, custom-designten siRNA-Sequenzen und einem Lipid-basierten Transfektionsreagenz behandelt. Es wurden RNAi-Experimente mit verschiedenen Trans-fektionsreagenzien durchgeführt, wobei jeweils die Menge an siRNA und Transfektionsreagenz so-wie auch die Sequenzen der siRNA-Doppelstränge an sich variiert wurden. Der Erfolg des Gen-knockdowns wurde anhand von Genexpressionsanalysen überprüft und die Daten per Kruskal-Wallis-Test ausgewertet. Da in der qRT-PCR die Wahl eines reliablen Kalibrators essenziell ist, wurde zu-nächst ein geeignetes ovines Referenzgen ermittelt, um die erhobenen Daten zu normalisieren. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit gelang es erstmals, Protokolle zu etablieren, die in ovinen VICs zu einer signifikanten Herunterregulierung der relativen Genexpression von BGN, OPN und CD73 füh-ren. Für HAS2 konnte kein signifikanter Gen-knockdown erreicht werden. Darüber hinaus wurden weiterführende Experimente durchgeführt, um funktionelle Auswirkungen des Gen-knockdowns von BGN und OPN unter degenerierenden und nicht-degenerierenden Bedingungen in vitro zu untersu-chen. qRT-PCR-Analysen ergaben, dass ein knockdown von BGN bzw. OPN die mRNA-Expression von ausgewählten, ebenfalls mit der DAVD assoziierten Genen (u. a. TLR2/4 bzw. MMP2/9) nicht signifikant beeinflusst. Weiterhin konnten Kalzium-Assay-Analysen zeigen, dass ein Gen-knockdown von OPN, nicht aber von BGN, einen Einfluss auf die Kalziumakkumulation in ovinen VICs unter degenerierenden Bedingungen zu haben scheint. In Übereinstimmung mit anderen Stu-dienergebnissen scheint OPN die Kalziumakkumulation unter degenerierenden Bedingungen in vitro zu hemmen und somit der zellulären Degeneration entgegenzuwirken. Die genaue Rolle der vier o. g. Moleküle bei den pathologischen Prozessen im Rahmen der DAVD ist noch nicht im Detail verstanden. Der in dieser Arbeit etablierte Gen-knockdown von BGN, OPN und CD73 stellt ein in vitro-Verfahren dar, auf dessen Grundlage diese Zusammenhänge in Zukunft vertieft untersucht werden können. Im Zentrum weiterführender Analysen sollte die Fragestellung stehen, ob und inwiefern die veränderte Expression dieser Moleküle in kalzifizierten Herzklappen Ursache oder Konsequenz der degenerativen Veränderungen ist.Degenerative aortic valve disease (DAVD) is one of the most prevalent cardiovascular diagnoses. Valvular interstitial cells (VICs) as well as several components of the valvular extracellular matrix seem to play a decisive role regarding the pathological changes of the native valve structure during DAVD. Four molecules are of special interest: the proteoglycan biglycan (BGN), the glycoprotein osteopontin (OPN) as well as the membrane-bound enzymes hyaluronan synthase 2 (HAS2) and ecto-5´-nucleotidase (CD73). Whereas BGN and OPN are associated with pro-degenerative effects, HAS2 and CD73 seem to have a protective impact concerning calcification processes. The primary objective of the present study is to establish a siRNA-mediated system resulting in a sufficient down-regulation of the mRNA expression of these four genes in ovine VICs. This gene knockdown is based on the principle of RNA interference (RNAi), which depends on specific small interfering RNA-(siRNA-)molecules triggering a cleavage of the complementary target mRNA resulting in a suppressed gene expression. For that purpose, ovine VICs were isolated from sheep aortic valves and treated with synthetic, cus-tom-designed siRNA sequences and a liposomal-based transfection reagent. RNAi experiments were performed using different transfection reagents, respectively modifying the amount of siRNA and transfection reagent as well as the sequences of the siRNA duplexes. The depletion of the targeted mRNA and therefore the success of gene silencing were detected by gene expression analysis, while data were analysed via Kruskal-Wallis test. Since a reliable calibrator is an essential requirement for qRT-PCR, at first a suitable ovine reference or housekeeping gene was determined to normalize data. The main result of the present study was the first-time establishment of transfection protocols lead-ing to a significant downregulation of the relative gene expression of BGN, OPN and CD73 in ovine VICs. A significant gene knockdown of HAS2 could not be achieved. Moreover, additional qRT-PCRs and Calcium Assays were performed to investigate functional effects of the siRNA-mediated gene knockdown of BGN and OPN under degenerating and not-degenerating conditions in vitro. It was shown that a decreased gene expression of BGN or OPN does not significantly influence the mRNA expression of further genes (e. g. TLR2/4 or MMP2/9) also being involved in the pathophysi-ology of DAVD. A gene knockdown of BGN did not lead to changes of the calcium concentration, whereas the gene knockdown of OPN appears to have an effect on the calcium accumulation in ovine VICs under degenerating conditions. In accordance with other studies, OPN seems to inhibit calcium accumulation under degenerating conditions in vitro and thus prevent cellular degeneration. The exact pathogenesis of DAVD has not been elucidated in detail yet, especially concerning the regulatory mechanisms of the four molecules mentioned above. In the present study, an in vitro method for efficient gene silencing of BGN, OPN and CD73 was successfully established allowing to further investigate these correlations. Following studies should focus on the issue whether and to what extent the degenerative changes during DAVD cause or are caused by the altered expression of these molecules in calcified aortic valves. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 27.09.2021 | |||||||
| Dateien geändert am: | 27.09.2021 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 19.10.2020 | |||||||
| Datum der Promotion: | 31.08.2021 |
