Dokument: Characterization and application of lignocellulose degrading oxidoreductases from Moniliophthora roreri

Titel:	Characterization and application of lignocellulose degrading oxidoreductases from Moniliophthora roreri
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=57378
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20210909-114008-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Bronikowski, Agathe [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 17,48 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 06.09.2021 / geändert 06.09.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Urlacher, Vlada B. [Betreuer/Doktorvater] PD Dr. Schulte, Ulrich [Gutachter]
Stichwörter:	Laccase, Manganese Peroxidase, Versatile peroxidase, Moniliophthora roreri, Lignin degradation, bioremediation
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	High-redox potential oxidoreductases as laccases and peroxidases are powerful enzymes with high potential for industrial biotechnology. They oxidize a vast variety of substrates, using only O2 or H2O2 as co-substrate, and can be used in the paper and pulp industry, food and pharmaceutical industry, for dye and drug degradation and lignin modification in biorefineries. However, their low availability due to low expression levels, limits their broad application. In the present three-part work, a laccase and a manganese peroxidase from the aggressive pathogenic fungus Moniliophthora roreri were produced with the help of the recombinant methylotrophic yeast Pichia pastoris. Subsequently the enzymes were purified and their biotechnological potential was explored. The expression levels achieved in a fed-batch fermentation for both the laccase Mrl2 (1.05 g per L) and peroxidase MrMnP1 (132 mg per L) were among the highest reported so far. In the first part of this doctoral thesis, biochemical characterization of the Mrl2 laccase was performed. The laccase showed a redox-potential of 0.58 V which categorizes it as a mid-redox potential laccase. Still, it showed high kcat values towards common laccase substrates and was able to degrade micropollutants 17α-ethinyl estradiol, estrone, 17β-estradiol, estriol and bisphenol A at neutral pH faster than high-potential laccases from Trametes versicolor. In the second part, the manganese peroxidase MrMnP1 from M. roreri was expressed and mutants thereof were constructed. Subsequently the mutated enzyme variants were characterized, and their biotechnological potential was examined. By replacing alanine 172 with tryptophane, an additional superficial active center was introduced, which enabled the oxidation of high redox potential substrates such as a non-phenolic lignin dimer. Such a superficial tryptophan is present in versatile peroxidases but not in manganese peroxidases. Thus, the original manganese peroxidase was redesigned into a versatile peroxidase. The mutants turned out to be more stable and had a broader substrate spectrum compared to the wild type. MnPs accept only Mn2+ as a substrate, which in turn can act as a redox mediator and oxidize other substrates. But also, MnPs that accept other substrates than Mn2+ have been described. Therefore, the role of manganese in dye degradation, catalyzed by MrMnP1 wild type and mutants thereof was evaluated. Interestingly, the degradation of crystal violet and Reactive Black 5 at pH 5 was inhibited by the addition of manganese, in contrast to pH 3, where manganese did not have an inhibitory effect but was even required for degradation by the wild-type enzyme. In the third part, both laccase and manganese peroxidase, were applied for enzymatic pretreatment of lignocellulose to enhance subsequent saccharification of this biomaterial by cellulases. The obtained glucose contained in the cellulose of lignocellulose from fast-growing perennial Miscanthus x giganteus could be used as a renewable raw material source in biorefineries. It is known that lignin prevents cellulases from degrading cellulose and pre-treatment is necessary. The mechanism of the inhibition however is not fully understood. Either the lignocellulose itself or liberated phenolic compounds may inhibit the cellulases. Treatment of Miscanthus with laccase and/or the peroxidase (with addition of H2O2 or a source thereof) resulted in higher released sugar amounts compared to non-pretreated Miscanthus. Analysis of the reaction mixture showed that the concentration of phenolic compounds was lower in the samples with laccase but not with the peroxidase. This suggests that the effect of the oxidoreductases may be related to the oxidation of the lignin in the lignocellulose rather than oxidation of the free phenolic compounds. Oxidoreduktasen mit hohem Redoxpotential wie Laccasen und Peroxidasen sind sehr leistungsfähige Enzyme, mit hohem Anwendungspotenzial in der industriellen Biotechnologie. Sie oxidieren eine Vielzahl von Substraten, wobei sie nur O2 oder H2O2 als Co-Substrat verwenden. Sie können in der Papier- und Zellstoffindustrie, in der Lebensmittel- und Pharmaindustrie, im Farbstoff- und Arzneimittelabbau und bei der Ligninmodifizierung in Bioraffinerien eingesetzt werden. Ihre geringe Verfügbarkeit, bedingt durch die geringe Expression, macht ihre industrielle Anwendung jedoch recht schwierig. In dieser dreiteiligen Arbeit wurden eine Laccase und eine Manganperoxidase aus dem aggressiven pathogenen Pilz Moniliophthora roreri mit Hilfe der methylotrophen Hefe Pichia pastoris rekombinant hergestellt. Anschließend wurden die Enzyme aufgereinigt und ihr biotechnologisches Potenzial untersucht. Das Expressionslevel in einer Fed-Batch-Fermentation sowohl für die Laccase Mrl2 (1,05 g pro L) als auch für die Peroxidase MrMnP1 (132 mg pro L) gehörte zu den höchsten, die bisher berichtet wurden. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Laccase Mrl2 biochemisch charakterisiert. Mrl2 zeigte ein Redoxpotential von 0,58 V, was sie in die Gruppe der Laccasen mit mittlerem Redoxpotential einreiht. Dennoch zeigte sie hohe kcat-Werte gegenüber gewöhnlichen Laccasesubstraten und war in der Lage, Mikroverunreinigungen wie 17α-Ethinylestradiol, Estron, 17β-Estradiol, Estriol und Bisphenol A bei neutralem pH-Wert schneller abzubauen als die hochpotenziellen Laccasen von Trametes versicolor. Im zweiten Teil wurde die Manganperoxidase aus M. roreri exprimiert und es wurden Mutanten davon hergestellt. Anschließend wurden die mutierten Enzymvarianten charakterisiert und ihr biotechnologisches Potenzial untersucht. Die Mutation A172W, die einem Trp gleicht, das in versatile Peroxidasen, aber nicht in Manganperoxidasen vorkommt, führte ein zusätzliches aktives Zentrum in das Enzym ein und ermöglichte die Oxidation von Substraten mit einem hohen Redoxpotential wie z.B. einem nichtphenolisches Lignindimer. Die Mutanten erwiesen sich als stabiler und hatten im Vergleich zum Wildtyp ein breiteres Substratspektrum. In der Fachliteratur wurden verschiedene Typen von MnPs beschrieben. MnPs, die nur Mn2+ als Substrat akzeptieren, das wiederum als Redox-Mediator fungieren und andere Substrate oxidieren kann. Aber auch MnPs, die andere Substrate als Mn2+ akzeptieren, wurden beschrieben. Aus diesem Grund wurde die Rolle von Mangan beim Farbstoffabbau untersucht. Interessanterweise wurde der Abbau von Kristallviolett und Reactive Black 5 bei pH 5 durch die Zugabe von Mangan gehemmt, im Gegensatz zu pH 3, wo Mangan keine hemmende Wirkung hatte, sondern sogar für den Abbau mit dem Wildtyp-Enzym erforderlich war. Im dritten Teil wurden sowohl Laccase als auch Manganperoxidase zur enzymatischen Vorbehandlung von Lignocellulose eingesetzt, um die nachfolgende Verzuckerung dieses Biomaterials durch Cellulasen zu verstärken. Die gewonnene Glukose, die in der Cellulose der Lignocellulose aus dem schnell wachsenden, mehrjährigen Miscanthus x giganteus enthalten ist, könnte als erneuerbare Rohstoffquelle in Bioraffinerien verwendet werden. Es ist bekannt, dass Lignin die Cellulasen daran hindert, Cellulose abzubauen, so dass eine Vorbehandlung erforderlich ist. Der Mechanismus der Hemmung ist jedoch nicht vollständig verstanden. Entweder die Lignocullulose selbst oder phenolische Verbindungen, die in die Flüssigkeit freigesetzt werden, können die Cellulasen hemmen. Miscanthus, der mit Laccase und/oder der Peroxidase (unter Zusatz von H2O2 oder einer Quelle davon) inkubiert wurde, führte im Vergleich zu nicht vorbehandeltem Miscanthus zu höheren freigesetzten Zuckermengen. Die Analyse der Flüssigkeit zeigte, dass die Konzentration der phenolischen Verbindungen in den Proben mit Laccase, aber nicht mit der Peroxidase, niedriger war. Dies deutet darauf hin, dass die Wirkung der Oxidoreduktasen eher mit der Oxidation des Lignins in der Lignocellulose zusammenhängt als mit der Oxidation der freien phenolischen Verbindungen.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	09.09.2021
Dateien geändert am:	09.09.2021
Promotionsantrag am:	08.02.2021
Datum der Promotion:	14.06.2021