Dokument: Der Einfluss eines hyperkaliämischen Zellarrests auf die Degradation und den Isoform-Switch des Titinfilaments in embryonalen Rattenkardiomyozyten
| Titel: | Der Einfluss eines hyperkaliämischen Zellarrests auf die Degradation und den Isoform-Switch des Titinfilaments in embryonalen Rattenkardiomyozyten | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=57367 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20210913-111137-7 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Schalla, Jakob [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Krüger, Martina [Gutachter] Prof. Dr.med. Joachim Schmitt [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Die longitudinalen Myofibrillen der Muskulatur lassen sich in transversale kontraktile Einheiten, genannt Sarkomere, unterteilen. Das Grundgerüst dieser Sarkomere basiert neben Aktin und Myosin auf dem Strukturprotein Titin, welches im Herzen in der längeren und elastischeren N2BA- und der kürzeren und steiferen N2B-Isoform koexprimiert wird. Hier erfolgt perinatal neben dem Abbau der fötalen N2BA-Isoform ein Isoform-Switch zugunsten der steiferen N2B-Form, weshalb insbesondere in embryonalen Kardiomyozyten ein erhöhter Turnover des Titinfilaments stattfindet. Dieser basiert vermutlich auf einer Beteiligung des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) und Autophagie. Jener Turnover sollte in unserem Ansatz über mechanische Arretierung und Induktion der zellulären Protein Qualitätskontrollmechanismen herbeigeführt werden, wobei die Inaktivierung zudem einen akzelerierenden Effekt auf den Titinisoform-Switch besitzen könnte. Hierfür haben wir das Modell der embryonalen Rattenkardiomyozyten (ERC) gewählt und die spontane Kontraktion der Zellen durch Kultivierung in einem hyperkaliämischen Nährmedium ab Tag 1 mechanisch unterbunden. Dabei bieten ERC aufgrund ihrer hohen Kontraktionsfrequenz und des ausgeprägten Titinisoform-Switchs die idealen Versuchsbedingungen. Während die Degradation und Isoform-Komposition des Titins per SDS-Gelelektrophorese detektiert wurde, quantifizierten wir repräsentative Abbaumarker durch Western Blots und stellten diese zusätzlich durch immunhistochemische Färbung dar.
Tatsächlich wiesen die arretierten Kardiomoyzyten eine verstärkte Titin-Degradation auf und präsentierten zudem einen reduzierten Titin-Gehalt. Neben der erhöhten K48- und K63-Ubiquitinierung des Titinfilaments konnte in den Versuchszellen eine erhöhte Anzahl an Proteasomen und eine verstärkte Autophagie-Aktivität nachgewiesen werden. Daneben zeigte sich der Titinisoform-Switch in den arretierten ERC beschleunigt. Hierbei könnte fehlende muskuläre Nutzung die beobachtete Degradation des Titinfilaments erklären, wobei Titin im Vergleich zu anderen Sarkomerproteinen bevorzugt abgebaut wurde. Dies wird in den arretierten Kardiomyozyten nach erfolgter Ubiquitinierung des Titinfilaments vermutlich durch komplementäre Aktivierung des UPS und der Autophagie vermittelt. Des Weiteren könnte der beschleunigte Titinisoform-Switch auf den vermehrten Abbau der embryonalen N2BA-Isoform und den reaktiven Einbau der N2B-Bande zurückgeführt werden. Somit lässt sich schlussfolgern, dass der Zellarrest vermutlich über Beteiligung des UPS und Autophagie zu einem erhöhten Abbau des Titinfilaments und zeitgleich zu einem beschleunigten Isoform-Switch führt.The longitudinal myofribrils of the musculature can be subdivided into transverse contractile units, called sarcomeres. In addition to actin and myosin, the backbone of these sarcomeres is based on the giant protein titin, which is co-expressed in the heart in the longer and more elastic N2BA- and the shorter and stiffer N2B-isoform. In addition to the perinatal degradation of the fetal N2BA-form an isoform-switch in favor of the stiffer N2B-isoform occurs. Therefore, an increased turnover of the titin filament takes place, especially in embryonic cardiomyocytes. Here, evidence suggests an involvement of the ubiquitin-proteasome system (UPS) and autophagy. As there is little known about this process, we wanted to investigate the breakdown of the titin filament in more detail. Via mechanical arrest we induced an increased turnover of the titin filament by activation of the protein quality control, which could also affect the titin-isoform-switch. For this purpose, we chose the embryonic rat cardiomyocyte (ERC) model and mechanically prevented spontaneous contraction of the cells by culturing them in a hyperkalemic growth medium from day 1. Here, ERCs provide the ideal experimental conditions because of their high contraction frequency and pronounced titin-isoform-switch. While titin-degradation and isoform-composition were detected by SDS gel-electrophoresis, we quantified the degradation markers by Western blots and visualized them by additional immunohistochemical staining. Indeed, arrested cardiomyocytes showed an enhanced titin degradation signal and reduced titin content. In addition to increased K48- and K63-ubiquitination of the titin filament, enhanced levels of proteasomes and amplified autophagic activity were detected in the experimental cells. Moreover, the titin-isoform-switch was shown to be accelerated in arrested ERCs. Lack of muscular utilization could explain the observed degradation of the titin filament, with titin being preferentially degraded compared with other sarcomeric proteins. This is presumably mediated in arrested cardiomyocytes after successful ubiquitination of the titin filament by complementary activation of the UPS and autophagy. Furthermore, the accelerated titin-isoform-switch could be attributed to increased degradation of the embryonic N2BA-isoform and increased incorporation of the N2B-band. Thus, it can be concluded that the cardioplegic cell arrest probably leads to increased degradation of the titin filament and an accelerated isoform-switch due to enhanced proteasomal and autophagosomal activity. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Herz- und Kreislaufphysiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 13.09.2021 | |||||||
| Dateien geändert am: | 13.09.2021 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 08.03.2021 | |||||||
| Datum der Promotion: | 31.08.2021 |
