Dokument: Faktoren der DNA-Schadensantwort als Zielstrukturen von Naturstoffen zur Behandlung von Tumoren

Titel:	Faktoren der DNA-Schadensantwort als Zielstrukturen von Naturstoffen zur Behandlung von Tumoren
Weiterer Titel:	DNA damage response as a target of natural compounds for the treatment of tumors
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=57326
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20210908-112240-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Aengenvoort, Jana [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 11,19 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 02.09.2021 / geändert 02.09.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Fritz, Gerhard [Gutachter] Prof. Dr. Proksch, Peter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Bei der konventionellen (i. e. genotoxischen) Tumortherapie wird die genomische DNA der malignen Zellen geschädigt. Infolge von induzierten DNA-Schäden wird ein komplexes Netz aus Signalwegen, die sogenannte DNA-Schadensantwort (DDR), aktiviert. Diese stellt die koordinierte Regulation der Aktivierung von Zellzyklus-Kontrollpunkten, der DNA-Reparatur und des Zelltodes sicher. Mechanismen der DDR sind daher attraktive Zielstrukturen für die Entwicklung neuer Therapieansätze. Gleichzeitig stellen Naturstoffe wichtige Leitsubstanzen für das Design neuer und wirksamer Krebsmedikamente dar. In dieser Arbeit sollten Naturstoffe identifiziert werden, die regulatorische Faktoren der DDR und der DNA-Reparatur beeinflussen. Der Fokus lag dabei nicht nur auf Naturstoffen, die per se einen Einfluss auf die DDR zeigen, sondern vor allem auf solchen, die die Tumortherapeutika-induzierte DDR modulieren und so die therapeutische Wirksamkeit konventioneller Therapien verbessern. Dazu wurden Pankreaskarzinom-Zelllinien als in vitro-Modellsysteme hinsichtlich ihrer Stressantworten nach Behandlung mit den Naturstoffen allein oder in Kombination mit Cisplatin (Cis) oder Doxorubicin (Doxo) untersucht. Zunächst wurde die Veränderung der Stärke der Phosphorylierung des Histons 2AX an seinem Serin 139 (γH2AX) als Surrogatmarker für DNA-Schäden in einer selbst neu etablierten Screening-Methode sowie mittels Western Blot-Analysen untersucht. Aus den Ergebnissen dieser Analysen geht hervor, dass Secalonic acid F (SA), 5-epi-Nakijiquinone Q (NQ) und 5-epi-Ilimaquinone (IQ) von insgesamt 296 untersuchten Naturstoffen zu den potentesten Naturstoffen in beiden Zelllinien zählen und in der Lage sind, das γH2AX-Signal nach Monotherapie sowie nach der Behandlung mit Cis oder Doxo zu verstärken. Anschließend erfolgte eine detaillierte molekulare Analyse des Einflusses der ausgewählten Naturstoffe auf die Induktion von DNA-Schäden, DNA-Schadensantwort und die damit einhergehenden Prozesse. Die Analysen für den Naturstoff SA ergaben, dass SA basal zu einer vermehrten Bildung von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) führt. Die Zytostatika-induzierte Menge an DSBs kann durch SA jedoch nicht weiter erhöht werden. Die zunehmende Menge von γH2AX in der Kombinationsbehandlung von SA und Cis scheint mit einer vermehrten Ausbildung von Cis-(1,2-GpG)-Addukten zu korrelieren. Die Resultate der Western Blot-Analysen ergaben, dass vor allem RPA32, als Marker für Replikationsstress, sowie CHK1 und CHK2 verstärkt phosphoryliert und somit aktiviert werden. Es gibt Hinweise darauf, dass SA in der Lage ist, die DNA-Reparatur in der Kombination sowohl mit Cis als auch mit Doxo zu hemmen und dadurch Zelltodmechanismen zu induzieren. Ebenso ist eine verminderte Aktivierung des G2/M-Kontrollpunktes durch SA in der Kombination mit Cis bzw. Doxo nicht ausgeschlossen. Im Gegensatz zu dem synergistisch zytotoxischen Effekt der Kombinationsbehandlungen in den Pankreaskarzinomzellen wird die Zytotoxizität der Zytostatika in nicht-malignen Fibroblasten durch SA minimiert. In primären Rattenhepatozyten wurde jedoch ein leicht hepatotoxischer Effekt detektiert. Die Resultate für NQ deuten bei einer Kombinationsbehandlung mit Doxo auf eine im Vergleich zur Doxo-Monobehandlung verstärkten Ausbildung an DSBs hin, was Grund für die vermehrte Menge an γH2AX sein könnte. Die Western Blot-Analysen ergaben eine vermehrte Phosphorylierung von RPA32 sowohl durch die NQ-Monobehandlung als auch eine im Vergleich zu dem jeweiligen Zytostatikum verstärkte Phosphorylierung in den Kombinationsbehandlungen. Die Befunde lassen den Schluss zu, dass NQ in einer Mono- sowie einer Kombinationsbehandlung zu replikativem Stress und gleichzeitig zu einer Reduktion der DNA-Reparatur führt, wodurch die Menge an Zytostatika-induzierten DNA-Schäden potenziert wird. Die Vitalität von primären Rattenhepatozyten wurde durch NQ nicht beeinflusst, jedoch reagieren nicht-malignen Fibroblasten sensitiv auf den Naturstoff. Die Befunde für IQ lassen die Vermutung zu, dass IQ in der Monobehandlung in der Lage ist, die DNA zu schädigen. Das Ergebnis der Untersuchung von an der DDR-beteiligten Proteine zeigte eine pleiotrope Beeinflussung der DDR. Es lässt sich aufgrund der Ergebnisse dieser Analysen vermuten, dass IQ seine Effekte auf die DDR möglicherweise über eine Verstärkung der ROS-Produktion ausübt und somit die Menge an oxidativen DNA-Schäden erhöht. In der Kombinationsbehandlung treten hauptsächlich additive zytotoxische Effekte auf, die nicht eindeutig in apoptotischem Zelltod resultieren. Im Gegensatz dazu reduziert IQ die Zytotoxizität der Zytostatika in nicht-malignen Fibroblasten und zeigt somit eine selektive zytotoxische Wirksamkeit in den getesteten Pankreaskarzinomzellen. In den primären Rattenhepatozyten konnte kein hepatotoxischer Effekt des Naturstoffes festgestellt werden. In der vorliegenden Arbeit konnte somit gezeigt werden, dass die ausgewählten Naturstoffe die DDR in Mono- oder Kombinationsbehandlung mit den Zytostatika Cis oder Doxo beeinflussen und nachfolgend Mechanismen der DNA-Reparatur und des Zelltodes so modulieren, dass die Effektivität der Behandlung in vitro gesteigert wird. In conventional (i.e. genotoxic) tumor therapy the genomic DNA of the malignant cells is damaged. As a result of induced DNA damage a complex stress response program named DNA damage response (DDR) is activated. This ensures a coordinated regulation of the activation of cell cycle checkpoints, DNA repair and cell death. Mechanisms of the DDR are therefore attractive target structures for the development of new therapeutic approaches. At the same time, natural compounds are important lead structures for the design of new and effective anticancer agents. In this work, natural compounds should be identified that influence regulatory factors of the DDR and DNA repair. The focus was not only on natural compounds that per se show an influence on the DDR, but also on those natural compounds above all that influence the anticancer agent induced DNA damage response and thus improve the therapeutic effectiveness of conventional anticancer agents. For this purpose, pancreatic carcinoma cell lines were examined as in vitro model systems regarding to their stress responses after the treatment with the natural compounds alone or in combination with cisplatin (Cis) or doxorubicin (Doxo). First, the alterations in the phosphorylation level of histone 2AX on its serine 139 (γH2AX) as a surrogate marker for DNA damage were investigated in a screening method that was recently established by ourselves, as well as through Western blot analyses. The results of these analyses demonstrate that out of a total of 296 natural compounds tested Secalonic acid F (SA), 5-epi-Nakijiquinone Q (NQ) and 5-epi-Ilimaquinone (IQ) are among the most potent natural compounds in both cell lines. They are able to induce the γH2AX signal after monotherapy and, moreover, intensify the signal intensity after treatment with Cis or Doxo. This was followed by a detailed molecular analysis of the influence of the selected natural compounds on the induction of DNA damage, DDR and associated processes. Analyses of the natural compound SA pointed out that SA leads to an enhanced formation of DNA double-strand breaks (DSBs). However, the amount of DSBs induced by the anticancer agents was not scaled up. The increased amount of γH2AX is independent of the intracellular Doxo concentration, but there seems to be a correlation between the increased amount of γH2AX in the combination treatment of SA and Cis and an enhanced formation of cis-(1,2-GpG)-adducts. The Western blot analyses showed that in particular RPA32, as a marker for replication stress, as well as CHK1 and CHK2 are phosphorylated more intensely than the respective control and thus activated. There is evidence that SA is able to inhibit DNA repair both in combination with Cis and Doxo and thereby induces cell death mechanisms. Likewise, reduced activation of the G2/M checkpoint by SA in combination with Cis or Doxo cannot be ruled out. In contrast to the synergistically cytotoxic effect of combination treatment in pancreatic cancer cells, the cytotoxicity of the anticancer agents in non-malignant fibroblasts is minimized by SA. In primary rat hepatocytes, however, a slightly hepatotoxic effect was detected. The results obtained for NQ indicate an elevated formation of DSBs in combination treatment with Doxo compared to Doxo monotreatment, which could be the reason for the increased amount of γH2AX. The western blot analyses illustrated an increased phosphorylation of RPA32 following the NQ monotreatment and an enhanced phosphorylation in the combination treatments compared to the respective anticancer agent alone. Presumably, NQ leads to replicative stress in mono- and combination treatment and at the same time to a reduction of DNA repair. Consequently, the amount of cytostatic-induced DNA damage is potentiated. The viability of primary rat hepatocytes was not influenced by NQ, but the non-malignant fibroblasts react sensitively to the natural compound. The findings for IQ suggest that IQ in monotreatment is able to damage the DNA. The result of the investigation of proteins involved in the DDR displayed pleiotropic effects. On the basis of the results of these analyses, we hypothesize that IQ seems to exert its effects on the DDR possibly by increasing ROS formation and thus increasing the amount of oxidative DNA damage. In combination treatment mainly additive cytotoxic effects occur, which, however, do not clearly result in apoptotic cell death. In addition, IQ reduces the cytotoxicity of the anticancer agents and thereby shows a selective cytotoxic activity in the tested pancreatic carcinoma cells. No hepatotoxic effect of the natural compound was found in the primary rat hepatocytes. In the present work it could be shown that the selected natural compounds influence the DDR in mono- or combination treatment with the anticancer agents Cis or Doxo and subsequently modulate the mechanisms of DNA repair and cell death, resulting in vitro in an increased efficacy of the therapy.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Toxikologie
Dokument erstellt am:	08.09.2021
Dateien geändert am:	08.09.2021
Promotionsantrag am:	13.04.2021
Datum der Promotion:	26.08.2021