Dokument: New Avenues in bio-NMR of Nucleic Acids and Membrane Systems
| Titel: | New Avenues in bio-NMR of Nucleic Acids and Membrane Systems | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=57316 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20220905-090252-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | M.Sc. Borggräfe, Jan [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Dr. Etzkorn, Manuel [Gutachter] Prof. Dr. Gohlke, Holger [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | NMR spectroscopy, solution NMR, DNAzymes, Membrane Systems | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | The main scope of this thesis is a comprehensive study of the structure and function of the RNA-cleaving 10-23 DNAzyme (Dz), which has a high therapeutic potential but it is limited in its activity in vivo. It could be demonstrated that the Dz is well accessible by solution NMR in all states of its catalytic cycle and under suitable conditions also high-resolution spectra of a pre-catalytic complex of Dz with its RNA target could be obtained. Using state-of-the-art techniques, such as exact NOEs, paramagnetic spinlabels and residual dipolar coupling, as well as novel approaches, like 19F experiments and homology restraints, the first structure of Dz could be determined giving unique insights into its function. A key feature of the calculated
structure is that Dz’s catalytic loop is winding around the RNA at height of its cleavage site and brings catalytically relevant nucleotides in close proximity to the scissile bond. Furthermore, the impact of metal ion cofactors was investigated, revealing that they are necessary to stabilize the Dz in an active conformation as well as being directly involved in the cleavage reaction. At least one Mg2+-binding site is located in the Dz’s catalytic loop close to the RNA cleavage site and is only formed in the catalytically active state. Temperature-gradient and real-time NMR experiments unveiled that product dissociation after cleavage might also be a limiting step in Dz’s catalysis. These findings are in agreement with additionally performed functional kinetic assays. These results provides a framework for further studies of other DNAzymes or variants and may lay the foundation for engineering theurapeutically active Dz variants. Moreover, studies on membrane-associated systems such as epidermal growth factor receptor (EGFR) and melanocortic-4 receptor (MC4R) were performed. The interplay between EGFR, which is linked to cancer development, and its potential modulators were investigated and the results point towards an additional regulation mechanism in EGFR signalling, which could be the focus of further in vivo studies. MC4R regulates food intake and is targeted by a variety of agonistic and antagonistic hormones. Studies performed on MC4R ligands revealed their strong interaction with negatively charged phospholipid bilayers, which might influence receptor activation and should be taken into account for future studies on MC4R-hormone interactions. Furthermore, NMR experiments could be performed on the transmembrane receptor bacterioopsin and it could be shown that incorporation of selectively 13C labelled and partially deuterated Leucines (Leu-methLD) significantly improve linewidths in methyl NMR spectra. Leu-methLD and 19F might serve as useful and widely applicable NMR-sensitive probes which can be introduced into protein or nucleic acid systems, respectively. This work provides comprehensive insights into several biologically relevant systems and describes novel methods which might open new avenues in biomolecular NMR.Ein wesentlicher Schwerpunkt dieser Arbeit sind Untersuchungen zur Struktur und Funktion des RNA-spaltenden 10-23 DNAzyms (Dz), welches ein hohes therapeutisches Potenzial besitzt, jedoch nur begrenzt in vivo aktiv ist. Es konnte gezeigt werden, dass das Dz allgemein in allen Zustände seines Katalysezyklus für die Lösungs-NMR gut zugänglich ist und unter geeigneten Bedingungen auch hochauflösende Spektren eines vorkatalytischen Komplexes mit seinem RNA-Substrat aufgenommen werden können. Mit modernsten Techniken, wie exact NOEs, paramagnetischen spinlabels und residual dipolar coupling sowie neuartigen Ansätzen, wie 19F-Experimenten und homology restraints, konnte die erste Struktur eines Dz ermittelt werden, welche einzigartige Einblicke in seine Funktion liefert. Ein Schlüsselmerkmal der berechneten Struktur ist, dass sich die katalytische Schleife des Dz in der Höhe der Schnittstelle um die RNA windet und damit katalytisch relevante Nukleotide in unmittelbarer Nähe der zu spaltenden Bindung bringt. Zusätzlich wird gezeigt, das Metall-Kationen das Dz in einer aktiven Konformation stabilisieren sowie direkt an der Spaltungsreaktion beteiligt sind. Mindestens eine Mg2+-Bindungsstelle befindet sich in der katalytischen Schleife des Dz und nahe der RNA-Schnittstelle und bildet sich nur im katalytisch aktiven Zustand des Komplexes aus. Temperaturgradienten- und Echtzeit-NMR-Experimente zeigten, dass Produktdissoziation nach dem RNA-Schnitt ebenfalls ein limitierender Schritt in der Katalyse von Dz sein könnte. Die Ergebnisse konnten mit zusätzlich durchgeführten funktionellen kinetischen Untersuchungen verifiziert werden. Diese Arbeit dient als Vorlage für weitere Studien an anderen DNAzymen oder Dz-Varienten und legt möglicherweise den Grundstein für die Entwicklung einer theurapeutisch aktiven Dz-Variante. Darüber hinaus wurden Studien an membranassoziierten Systemen wie dem epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) und dem Melanocortin-4-Rezeptor (MC4R) durchgeführt. Das Zusammenspiel zwischen EGFR, welcher mit Krebsentstehung zusammenhängt, und seinen möglichen Modulatoren wurden untersucht und die Ergebnisse deuten auf einen zusätzlichen Regulationsmechanismus bei der EGFR-Signalübertragung hin, der Schwerpunkt weiterer in-vivo-Studien sein könnte. MC4R reguliert die Nahrungsaufnahme und wird von einer Vielzahl von agonistischen und antagonistischen Hormonen angesteuert. Studien an MC4RLiganden zeigten starke Interaktion mit negativ geladenen Phospholipid-Membranen, welche die Rezeptoraktivierung beeinflussen könnten und bei zukünftigen Studien zu MC4R-Hormon-Wechselwirkungen berücksichtigt werden sollten. Zusätzlich wurden NMR-Experimente an dem Transmembranrezeptor Bacterioopsin durchgeführt und gezeigt, dass der Einbau von selektiv 13C-markierten und teilweise deuterierten Leucinen (Leu-methLD) die Linienbreiten in Methyl-NMR-Spektren signifikant verbesserte. Leu-methLD und 19F könnten als günstige und breit einsetzbare NMR-Sonden für Protein- bzw. Nukleinsäuresysteme dienen. Diese Arbeit liefert detailierte Einblicke in verschiedene biologisch relevante Systeme und erläutert neuartige Methoden, welche neue Wege in der biomolekularen NMR eröffnen. | |||||||
| Quelle: | This semi-cumulative dissertation covers, in addition to unpublished results, full or partially the following publications:
* H. Rosenbach, J. Borggräfe, J. Victor, C. Wuebben, O. Schiemann, W. Hoyer, G. Steger, M. Etzkorn, I. Span. Influence of monovalent metal ions on metal binding and catalytic activity of the 10-23 DNAzyme. Biological Chemistry, 402(1):99, 2020 * H. Rosenbach, J. Victor, J. Borggräfe, B. Ralf, G. Steger, E. Manuel, I. Span. Expanding crystallization tools for nucleic acid complexes using U1A protein variants. Journal of Structural Biology, 210(2):107480, 2019. * A. Viegas, D.M. Yin, J. Borggräfe, T. Viennet, M. Falke, A. Schmitz, M. Famulok, M. Etzkorn. Molecular Architecture of a Network of Potential Intracellular EGFR Modulators: ARNO, CaM, Phospholipids, and the Juxtamembrane Segment. Structure, 12(1):54, 2020 * A. Dubey, N. Stoyanov, T. Viennet, S. Chhabra, S. Elter, J. Borggräfe, A. Viegas, R.P. Nowak, N. Burdzhiev, O. Petrov, E.S. Fischer, M. Etzkorn, V. Gelev, H. Arthanari. Local deuteration enables NMR observation of methyl groups in proteins from eukaryotic and cell-free expression systems. Angewandte Chemie, 60(25):13783, 2021 All references are listed in the Bibliography section. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Bezug: | Experimental planning, data collection, analysation, evaluation and writing was conducted between October 2015 and September 2020 | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 05.09.2022 | |||||||
| Dateien geändert am: | 05.09.2022 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 17.09.2020 | |||||||
| Datum der Promotion: | 31.03.2021 |
