Dokument: Entwicklung von APEX2-Fusionskonstrukten zur Analyse der subzellulären Proteinprozessierung
| Titel: | Entwicklung von APEX2-Fusionskonstrukten zur Analyse der subzellulären Proteinprozessierung | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=57237 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20210830-111557-7 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Stock-Schröer, Annika Marie [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Klöcker, Nikolaj [Gutachter] PD Dr. med. Stegbauer, Johannes [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Die elektrische Erregbarkeit einer Zelle wird durch die Anzahl und Art von Ionenkanälen in ihrer Zellmembran bestimmt. Das subzelluläre Transportverhalten von Ionenkanälen wird genau wie das biophysikalische Verhalten u.a. auch von akzessorischen Untereinheiten determiniert.
Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Etablierung von Untersuchungsmethoden zur Charakterisierung der subzellulären Prozessierung von Ionenkanälen. Zunächst wurde ein Verfahren etabliert, das eine Kompartiment-spezifische Biotinylierung mit anschließender Aufreinigung und Proteomanalyse von Ionenkanälen und Interaktionspartnern erlaubt. Dazu wurde eine konstruierte Peroxidase (APEX2) durch Fusion mit spezifischen Signalsequenzen in einzelne Kompartimente geschleust und lokal aktiviert. Anschließend wurden die biotinylierten Proteine mittels Streptavidin-beschichteten beads aufgereinigt. In einer zweiten Experimentalreihe wurde mittels quantitativer real-time-PCR (qPCR) die mRNA-Expression von HCN-Kanälen und ihrer akzessorischen Untereinheit Trip8b in peripheren kardialen Ganglienzellen der Maus untersucht. HCN-Kanäle werden in zentralen Neuronen durch Trip8b sowohl in der Expression an der Zelloberfläche als auch in der Modulierbarkeit durch zyklische Nukleotide beeinflusst. Diese Interaktion ist in peripheren Neuronen bislang nicht näher untersucht. Die APEX2-Fusionsproteine mit Signalsequenzen für das endoplasmatische Retikulum, den Golgi-Komplex und die Zellmembran zeigten in der Immunocytochemie sowohl eine spezifische Sortierung als auch eine auf das Kompartiment be-grenzte Biotinylierungs-Aktivität. Auch im Western Blot konnte die Aktivität der Konstrukte nachgewiesen werden. In den kardialen Ganglien der Maus konnte die Expression der HCN2 Isoform mittels qPCR nachgewiesen werden. Andere Isoformen der HCN-Kanalfamilie waren hingegen kaum exprimiert. Auch Trip8b konnte nur in so geringem Maße nachgewiesen werden, dass eine weitere Untersuchung nicht möglich war. Die hier vorgelegten Ergebnisse schaffen die Basis für eine spezifische Weiterentwicklung von Methoden zur Untersuchung der subzellulären Proteinprozessierung.The electrical excitability of a cell is determined by the type and number of ion channels in its membrane. The subcellular transport of an ion channel, as well as its biophysical behavior, is often influenced by auxiliary subunits. The aim of this present work was to develop and establish methods to characterize subcellular processing of proteins. Therefore, a technique was established, which allows a compartment-specific biotinylation, followed by purification and analysis of the proteome including its interaction partners. For this purpose, a designed peroxidase (APEX2) was introduced into different cell compartments by fusion with specific signal sequences and activated locally. Biotinylated proteins were purified by streptavidin-coated beads. A second series of experiments used the quantitative real time PCR (qPCR) method to examine the mRNA expression of HCN-channels and their auxiliary subunit Trip8b in peripheral cardiac ganglion cells of the mouse. In central neurons, HCN-channels are influenced by their auxiliary subunit Trip8b. It regulates their expression on the cell surface and modulates their sensitivity to cyclic nucleotides. Those interactions with Trip8b have not yet been studied in peripheral neurons. The present work could demonstrate by immunocytochemistry that the APEX fusion proteins with signal sequences for the endoplasmatic reticulum, golgi apparatus and cell surface showed a specific subcellular sorting as well as a compartment-limited biotinylation activity. Also, Western blot analysis demonstrated the activity of respective fusion proteins. Mouse cardiac ganglia express the HCN 2 isoform, demonstrated by qPCR. Other isoforms of HCN-channels were very rarely expressed, as well as the neuronal auxiliary subunit Trip8b. Those results establish a basis for further specific development of methods to examine subcellular protein processing. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Neuro- und Sinnesphysiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 30.08.2021 | |||||||
| Dateien geändert am: | 30.08.2021 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 02.12.2020 | |||||||
| Datum der Promotion: | 19.08.2021 |
