Dokument: Metalloproteins as Sustainable Biocatalysts Enhancement and Characterization of Different Systems for Effective Catalytic Applications

Titel:	Metalloproteins as Sustainable Biocatalysts Enhancement and Characterization of Different Systems for Effective Catalytic Applications
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=57090
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20220920-100245-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	M.Sc. Mielenbrink, Jan Steffen [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 55,73 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 12.08.2021 / geändert 12.08.2021
Beitragende:	Jun.-Prof. Dr. Span, Ingrid [Gutachter] Prof. Dr. Zurbriggen, Matias [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Metalloproteine vereinigen die Reaktivität von Metallen mit der Selektivität der Proteinumgebung. Hierbei können verschiedene Übergangsmetalle, wie beispielsweise Eisen und Kupfer, ähnliche biologische Rollen erfüllen, die von Elektronentransport bis hin zu Redox-Katalyse reichen. Evolutionär betrachtet, spielten Eisen-Schwefel-Proteine (Fe-S-Proteine) eine dominante Rolle in einer Zeit, bevor die Sauerstoffkonzentration anstieg. Die höhere Konzentration an Sauerstoff in der Luft führte dazu, dass die sauerstoffempfindlichen Kofaktoren teilweise von anderen Übergangsmetallen, wie Kupfer, ersetzt wurden. Trotzdem spielen Fe-S-Proteine, wie auch Kupferproteine, weiterhin eine zentrale Rolle in der Übertragung von Elektronen und der Katalyse von Redox-Prozessen. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Untersuchung von Struktur und Funktion natürlich vorkommender Eisen- und Kupfer-haltigen Enzymen, sowie der Herstellung und Charakterisierung von artifiziellen Kobalt-Schwefel-Proteinen (Co-S-Proteinen). Der Fokus liegt insbesondere auf der Assemblierung natürlicher Fe-S- und artifizieller Co-S-Kofaktoren und ihrem Einbau in eine Proteinumgebung. Das Ziel ist es, die Funktionsweise natürlicher Redox-Katalysatoren zu verstehen und artifizielle Biokatalysatoren mit verbesserten Eigenschaften für biotechnologische Anwendungen herzustellen. Der erste Artikel (Mielenbrink et al. (2020) Maturation of Fe–S Cluster Containing Proteins) beschreibt die systematische Untersuchung unterschiedlicher Maturierungsstrategien für verschiedene [4Fe-4S]-Proteine in vitro und in vivo. Bisher ist der Einfluss unterschiedlicher Strategien auf die Maturierung von Fe-S-Proteinen nicht detailiert untersucht worden. Hierzu wurde die Vollständigkeit des Cluster-Einbaus verschiedenster in vivo Syteme mit denen der auf Apo-Proteine angewendeten in vitro Methoden verglichen. Dazu zählen Expressionssysteme mit erhöhter Fe-S-Cluster Assemblierungsaktivität und chemische sowie semienzymatische Rekonstitution. Unsere Studien konnten zeigen, dass die erfolgreiche Synthese von Fe-S-Proteinen stark von der Maturierungsstrategie abhängen kann. Das zeigt, wie wichtig es ist, kein allgemeines Protokoll für die Entwicklung von Fe-S-Proteinen zu nutzen, um ein optimales Ergebnis aus der Herstellung von Fe-S-Proteinen zu erzielen. Hierdurch konnte die Isolierung des radical SAM-Enzyms ThnB, welches bisher nur in vitro maturiert werden konnte, entscheidend verbessert werden. Unsere Studien leisten darüber hinaus einen systematischen Beitrag zu der Entwicklung von Fe-S-Proteinen als nachhaltige Biokatalysatoren. Der zweite Artikel (Mielenbrink et al. (2021) Co–S Cluster Assembly in Fe–S Proteins) präsentiert die erste in vitro Maturierung künstlicher Co-S-Cluster in verschiedenen Fe-SProteinen, sowie deren Cluster-Transfer-Interaktionen mit Zielproteinen. Künstliche Co-SProteine stehen im Verdacht zur effektiven biokatalytischen Gewinnung von Wasserstoff als Energiequelle genutzt werden zu können. Dazu wurde bakterielles Fe-S-Cluster-Gerüstprotein IscU aus verschiedenen Organismen verwendet, Co-S-Cluster in vitro mittels chemischer und semienzymatischer Rekonstitution zu assemblieren. Die spektroskopischen Eigenschaften dieser Cluster wurden charakterisiert und mit spektroskopischen Daten aus der Literatur verglichen, um Hinweise auf das Vorhandensein eines künstlichen Co-S-Clusters in IscU zu finden. Darüber hinaus wurden Punktmutationen dazu verwendet, den zusammengesetzten Co-S-Cluster für eine längere Zeit unter aeroben Bedingungen zu stabilisieren. In diesem Artikel präsentieren wir erste Hinweise dafür, dass Co-S-Cluster erstmalig in eine Proteinumgebung eingebaut wurden. Elektronenabsorptionsspektroskopie (EAS), Zirkulardichroismusspektroskopie (CD) und Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) wurden dazu genutzt, Hinweise für die Existenz von Co-S-Clustern in IscU zu untermauern. Zusätzlich weisen erste Experimente darauf hin, dass diese Cluster sogar auf Zielproteine übertragen werden können. Dies ist ein entscheidender Schritt in Richtung effektiver biokatalytischer Gewinnung vonWasserstoff auf Co basierenden künstlichen Biokatalysatoren zur nachhaltigen Energiegewinnung. Der dritte Artikel (Olbrich et al. (2021) Blue Multicopper Oxidases T1 Cu Axial Ligand Mutations) befasst sich auch mit einem nachhaltigen Biokatalysator: der Multikupfer Oxidase Ssl1. Diese Enzyme katalysieren die Ein-elektronen-oxidation von Substratmolekülen mit O2 als Co-Substrat und H2O als Nebenprodukt. In diesem Artikel untersuchen wir die Bedeutung des axialen Liganden von T1 Cu in Ssl1 für seine katalytische Aktivität in Bereichen des Umweltschutzes, wie z.B. der Detoxifizierung von Schadstoffen oder der Bioremediation, um die Möglichkeiten in der Anwendung zu erweitern. Fünf verschieden Mutationen des axialen Liganden wurden eingeführt und mit Elektronenspinresonanzspektroskopie, CD, EAS, sowie Kristallstrukturanalyse untersucht. Für alle fünf Varianten konnten wir die Kristallstruktur lösen, was uns detaillierte Informationen über die Abhängigkeiten der katalytischen Aktivität von strukturellen Veränderungen liefert. Die spektroskopischen Ergebnisse sowie Stopped- Flow Messungen untermauern die Wichtigkeit des axialen Liganden von T1 Cu in Ssl1 für seine katalytische Aktivität. Dieser Artikel fördert die Anwendungsmöglichkeiten dieser nachhaltigen Katalysatoren. Abschließend liefert die gesamte Arbeit interessante und wichtige Ergebnisse insbesondere auf dem Gebiet der Metalloproteine für den Einsatz als "grüne" Katalysatoren in der H2-Produktion als nachhaltige Energiequelle oder im Umweltschutz und trägt daher dazu bei, einige der größten Herausforderungen unseres Jahrhunderts zu meistern. Metalloproteins combine the reactivity of metals with the selectivity of the protein environment. Various transition metals, such as iron and copper, can exert similar biological roles, ranging from electron transport to redox catalysis. Evolutionary, iron-sulfur (Fe–S) proteins played a dominant role before the oxygen concentration increased. Due to a higher concentration of oxygen in the air, the oxygen-sensitive cofactors were partially replaced by other transition metals, such as copper. Nevertheless, both Fe–S proteins and copper proteins remain essential for the transfer of electrons and the catalysis of redox processes. The present work aims at understanding the structure and function of naturally occurring Fe–S and copper-containing enzymes, as well as the production and characterization of artificial cobalt-sulfur (Co–S) proteins. The focus is on unravelling the assembly of natural Fe-S clusters and apply this knowledge for the generation of artificial Co–S cofactors and their incorporation into Fe-S scaffold proteins. The goal is to understand natural redox catalysts and to produce artificial biocatalysts with improved properties for biotechnological applications. The first article (Mielenbrink et al. (2020) Maturation of Fe–S Cluster Containing Proteins) describes different maturation strategies for three well-characterized [4Fe–4S] proteins in vitro and in vivo. Yet, the influence of different strategies on the maturation of Fe–S proteins has not been investigated in detail. Therefore, the completeness of cluster assembly of various in vivo systems was compared with in vitro methods applied to apo-proteins. These include expression systems with increased Fe–S cluster assembly activity and chemical and semi-enzymatic reconstitution. Our studies show that the successful synthesis of Fe–S proteins can strongly depend on the maturation strategy. This underlines how important it is not to use a general protocol for the development of Fe–S proteins in order to get an optimal result from the maturation of Fe–S proteins. Hereby, the isolation of holo radical SAM enzyme ThnB, which could only be matured in vitro, could be significantly improved. Our results will enable the production of Fe–S protein that are correctly maturated and, thus, will contribute to an improved understanding of this highly divers metalloprotein family. The second article (Mielenbrink et al. (2021) Co–S Cluster Assembly in Fe–S Proteins) presents the first in vitro maturation of artificial Co–S clusters in various Fe–S protein scaffolds, as well as their cluster transfer interactions with target proteins. Cobalt has emerged as one of the most promising transition metal for the production of hydrogen gas. Thus, artificial Co–S proteins have a great potential for biocatalytic hydrogen production. The bacterial Fe–S cluster scaffold protein IscU from various organisms was used to assemble Co–S clusters in vitro using chemical and semi-enzymatic reconstitution. Electron absorption spectroscopy (EAS), circular dichroism spectroscopy (CD) and inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) support the formation of Co–S species in IscU proteins from different organisms. In addition, a point mutation was introduced in Archaeoglobus fulgidus IscU to increase the stability of the Co-S cluster under aerobic conditions. Our data present the first evidence for a protein-bound Co–S cluster. In addition, initial experiments indicate that these clusters can even be transferred to other apo proteins implying the possibility that IscU can be used to generate a large variety of artificial metalloproteins. This is an important step towards the generation of hydrogen on Co-based artificial biocatalysts for a sustainable energy production. The third article (Olbrich et al. (2021) Blue Multicopper Oxidases T1 Cu Axial Ligand Mutations) also focuses on a sustainable biocatalyst: the multicopper oxidase Ssl1. These enzymes catalyze the one-electron oxidation of substrate molecules with O2 as co-substrate and H2O as by-product. In this article we investigate the importance of the axial ligand of T1 Cu in Ssl1 for its catalytic activity in environmental protection processes, such as the detoxification of pollutants or bioremediation, in order to expand their applications. Five different mutations of the axial ligand were introduced and investigated using electron paramagnetic resonance spectroscopy, CD spectroscopy, EAS, and x ray crystallography. We were able to solve the crystal structures of five variants, which provides insights on the structural changes accompanying the exchange of one ligand of the T1 Cu site in Ssl1. The spectroscopic results and stopped-flow measurements reveals how the axial ligand of T1 Cu in Ssl1 influences the catalytic activity. Finally this thesis provides interesting and important results in the field of metalloproteins, especially for the usage as sustainable catalysts in H2 production as energy source or in the protection of environmental pollutions and therefore contributes to tackle some of the biggest challenges of our century.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	20.09.2022
Dateien geändert am:	20.09.2022
Promotionsantrag am:	01.06.2021
Datum der Promotion:	23.07.2021