Dokument: Charakterisierung MHC Klasse II-restringierter Prozessierungs- und Präsentationswege von MVA-produzierten Antigenen

Titel:	Charakterisierung MHC Klasse II-restringierter Prozessierungs- und Präsentationswege von MVA-produzierten Antigenen
Weiterer Titel:	Characterization of MHC II-restricted processing and presentation pathways of MVA-delivered antigens
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=57059
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20220905-083457-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kamolz, Patricia [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,61 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 01.08.2021 / geändert 01.08.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Drexler, Ingo [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Däubener, Walter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Bei Infektionskrankheiten und bei der Immuntherapie von Tumoren sind Impfstoffe auf Basis von rekombinanten MVA als Vektorvakzine in klinischer Erprobung. Neben den CD8+ T-Zellen kommt den CD4+ T-Zellen bei der Immunantwort eine besondere Bedeutung zu. Etwa 20% der Peptide, die über MHC Klasse II Komplexe an CD4+ T-Zellen präsentiert werden, stammen aus intrazellulären Quellen. Verschiedene Studien ließen den Schluss zu, dass dies auf Autophagie zurückzuführen sein könnte. Da bisher nicht genau bekannt ist, wie pockenvirale Antigene prozessiert werden müssen, um effizient CD4+ T-Zellen zu aktivieren, wurde im Folgenden versucht, die MHC Klasse II restringierten Prozessierungs- und Präsentationswege von MVA-produzierten Antigenen näher zu charakterisieren. Hierfür koppelten wir das Modelantigen Ovalbumin, dessen Sekretionssequenz entfernt wurde, an das autophagosomal-assoziierte Membranprotein LC3-II. Das entstandene Fusionsgen wurde in das Genom (Deletion VI) von MVA integriert, so dass das Virus MVA-nsOVA/LC3_P11 entstand. Wir erhofften uns, das Fusionsprotein über Autophagie gezielt in den MHC Klasse II Präsentationsweg einschleusen zu können. Wir konnten zeigen, dass das Fusionsgen nsOVA/LC3 erfolgreich in das Genom von MVA eingefügt werden konnte. Des Weiteren wurde das Fusionsprotein nicht sekretiert; allerdings war die gebildete Proteinmenge sehr gering und die Proteinproduktion verspätet. Unsere Analysen zeigten, dass dieser Umstand wahrscheinlich zum einen auf die Entfernung der Sekretionssequenz und zum anderen auf die Eigenschaften des späten Promotor P11 zurückzuführen ist. Sowohl Proteasom- als auch Autophagieinhibitoren führten zu einer Abnahme der gebildeten Proteinmenge. Beide Abbauwege könnten daher für die MHC Klasse II Präsentation relevant sein. Teilweise gelang der Nachweis einer Integration des Fusionsproteins in eine membranöse Struktur. Hinsichtlich der Aktivierung von OVA-spezifischen CD4+ T-Zellen zeigte MVA-nsOVA/LC3_P11 gegenüber dem Kontrollvirus MVA-nsOVA_P11 keine signifikanten Vorteile. Insgesamt zeigten die OVA-spezifischen CD4+ T-Zellen eine nur geringe Aktivität. Hierbei konnten sowohl eine nicht adäquate Infektion der APZs sowie ein Versagen der OVA-spezifischen CD4+ T-Zellen als ursächlich ausgeschlossen werden. Der Nachweis der Kolokalisierung zwischen LC3 und Ovalbumin in der Konfokalmikroskopie gestaltete sich schwierig. Letztendlich muss diskutiert werden, ob die ausbleibende CD4+ T-Zellaktivierung auf das Viruskonstrukt an sich selbst zurückzuführen ist oder ob MVA alternative Wege der Autophagie verwendet, die unabhängig von der Bildung von Autophagosomen sind Vaccines based on modified vaccinia virus Ankara (MVA) are in clinical testing as vector vaccines for therapy of infectious diseases and immunotherapy of cancer. For protective immune responses both, CD 8+ T-cells as well as CD 4+ T-cells are considered relevant. Nearly 20% of the peptides which are presented by MHC class II complexes to CD 4+ T-cells are derived from intracellular sources. Several studies concluded that this may be traced back to autophagy. It is not known exactly by which antigen processing routes poxviral antigens have to be processed in order to activate CD4+ T-cells efficiently. This is the reason why we tried to characterize known MHC II-restricted processing and presentation pathways for MVA-delivered antigens. For this purpose we removed the secretory sequence from the model antigen ovalbumin and linked it to LC3-II, which is an essential autophagosome-associated membranprotein. Afterwards, we integrated an expression cassette encoding this recombinant fusion gene into the genome (deletion VI) of MVA resulting in the recombinant virus MVA-nsOVA/LC3_P11. By this method we expected to target viral antigens directly to the autophagy-mediated pathway of MHC II class loading. We were able to show that the fusion gene was successfully integrated into the genome of MVA. As expected, the fusion protein was not secreted but the amount of protein was very low and the production started with a marked delay. Our studies showed this was not only due to the removal of the secretory sequence potentially leading to instability but also because of the characteristics of the late promotor P11. Both, proteasome inhibitors and autophagy inhibitors resulted in a reduced amount of protein. Therefore, we drew the conclusion that both pathways might be important for MHC class II presentation. The integration of nsOVA into a membranous structure by LC3-II was inconsistently detectable – depending on the cell type. Regarding the activation of OVA-specific CD4+ T-cells, we saw no significant difference between MVA-nsOVA/LC3_P11 and the control virus MVA-nsOVA_P11. It should be mentioned that after infection with both viruses the activity of the OVA specific CD4+ T-cells was unexpectedly low. Both, inadequate infection of the APCs and malfunction of OVA-specific CD4+ T-cells could be excluded as a reason for this problem. Moreover it was very difficult to see colocalisation between LC3 and OVA by confocal microscopy. Taken together, it is still an open question if the missing activation of CD4+ T-cells was caused by the low recombinant target gene expression or if MVA takes alternative autophagic pathways which are independent of autophagosomes or the lipidation of LC3. In order to answer this question further studies will be necessary.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Virologie
Dokument erstellt am:	05.09.2022
Dateien geändert am:	05.09.2022
Promotionsantrag am:	31.12.2020
Datum der Promotion:	27.07.2021