Dokument: Untersuchungen zur Rolle mutierter Isocitrat-Dehydrogenase 1 und des DNA-Reparaturenzyms ALKBH2 für das Ansprechen von Glioblastomzellen auf alkylierende Zytostatika
| Titel: | Untersuchungen zur Rolle mutierter Isocitrat-Dehydrogenase 1 und des DNA-Reparaturenzyms ALKBH2 für das Ansprechen von Glioblastomzellen auf alkylierende Zytostatika | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=56919 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20210728-105011-9 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Scherbaum, Vanessa Sarah [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. med. Reifenberger, Guido [Gutachter] PD Dr. med Rapp, Marion [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Glioblastom, IDH1-Mutation, Reparaturenzyme, ALKBH2 | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Die Hypothese der vorliegenden Arbeit war, dass der Onkometabolit D-2-Hydroxyglutarat (D-2-HG) zu einer kompetitiven Hemmung des α-Ketoglutarat-abhängigen Reparaturenzyms AlkB Homolog 2 (ALKBH2) in IDH1-R132H-mutierten Gliomzellen und hierdurch zur Reduktion der ALKBH2-vermittelten Resistenzbildung gegenüber DNA-Alkylanzien führt. IDH1-Mutationen kommen in Oligodendrogliomen und diffusen astrozytären Gliomen einschließlich eines Teils der Glioblastome vor. Sie führen statt der Bildung von α-Ketoglutarat (α-KG) zur Bildung von D-2-Hydroxyglutarat (D-2-HG). Zur Untersuchung der o.g. Hypothese wurden die Glioblastomzelllinien A-172, LN-18, LN-229 und U-87 MG mit einem Plasmid, welches entweder das IDH1-Wildtyp (Wt) oder das IDH1-R132H mutierte Protein kodiert, stabil transfiziert. Die IDH1-Wt- oder IDH1-R132H-transfizierten Glioblastomzelllinien wurden mit den Zytostatika Doxorubizin, Lomustin (CCNU) oder den beiden monofunktionalen DNA-Alkylanzien Methylmethansulfonat (MMS) und Temozolomid (TMZ) behandelt und die Sensitivität gegenüber diesen Zytostatika mittels Zytotoxizitätsassays bestimmt. Entsprechend der Hypothese einer Hemmung von ALKBH2 durch D-2-HG wurde ein stärkeres Ansprechen der IDH1-R132H-transfizierten Glioblastomzellen auf MMS nach 1-stündiger Behandlung im Konzentrationsbereich von 3-6 mM und nach anschließender 48-stündiger Kultivierung der Zellen gefunden. Im Gegensatz hierzu war bei der kontinuierlichen Behandlung der Zellen mit MMS bzw. TMZ über 10 Tage kein Unterschied zwischen den IDH1-Wt- und den IDH1-R132H-transfizierten Zellen vorhanden. Bei diskontinuierlicher wie auch bei kontinuierlicher Behandlung der Zellen mit MMS ließ sich weder bezüglich der relativen Protein- noch der relativen mRNA-Expression von ALKBH2 ein Unterschied zwischen IDH1-Wt- und IDH1-R132H-transfizierten Glioblastomzellen feststellen. Die für IDH1-R132H-transfizierte Glioblastomzellen beobachtete erhöhte Zytostatikaempfindlichkeit war in Zelllinien mit TP53-Mutation und/oder Expression des DNA-Reparaturenzyms O6-Methylguanin DNA-Methyltransferase (MGMT) nicht nachweisbar. Das Protein p53 ist an der Regulation der Expression des Enzyms ALKBH2 beteiligt. Der fehlende indirekte Nachweis einer Funktionsminderung von ALKBH2 in IDH1-R132H-transfizierten Glioblastomzellen mit TP53-Mutation spricht für eine durch die TP53-Mutation vermittelte Störung der Expressionsregulation von ALKBH2, welche unabhängig vom IDH1-Mutationsstatus ist. Die Beobachtung, dass nur MGMT-defiziente Glioblastomzellen mit IDH1-Mutation stärker auf MMS reagierten, weist auf die dominante Bedeutung von MGMT für die Resistenz von Gliomzellen gegenüber DNA-Alkylanzien hin. Die Ergebnisse dieser Arbeit könnten bedeuten, dass Patienten, deren Tumoren zusätzlich zu einem Verlust der MGMT-Expression durch Hypermethylierung des MGMT-Promotors eine Mutation von TP53 und/oder IDH1 aufweisen, stärker von einer Therapie mit Temozolomid profitieren als Patienten, deren Tumoren die entsprechenden Mutationen nicht aufweisen. Diese Hypothese passt zu der klinischen Beobachtung, dass IDH1-mutierte Gliome besser auf Chemotherapie ansprechen als IDH1-Wildtyp Gliome.This dissertation proposes and tests the hypothesis that the oncometabolite D-2-hydroxyglutarate (D-2-HG) competitively inhibits the α-ketoglutarate (α-KG)-dependent repair enzyme AlkB homolog 2 (ALKBH2) in IDH1-R132-mutant cells and that this inhibition results in a reduced ALKBH2-mediated resistance towards monofunctional alkylating agents. IDH1 mutations are common in oligodendrogliomas and in diffuse astrocytic gliomas including some glioblastomas. They lead to the production of D-2-HG instead of α-KG. To test the proposed hypothesis, the glioblastoma cell lines A-172, LN-18, LN-229, and U-87 MG were transfected with plasmid DNA that encoded either the IDH1-R132H mutant or the IDH1-wildtype (IDH1-Wt) sequences. The IDH1-Wt- or IDH1-R132H-transfected glioblastoma cell lines were treated with the cytostatic substances doxorubicine, lomustine or the two monofunctional alkylating agents methylmethanesulfonate (MMS) and temozolomide (TMZ).
The sensitivity of glioblastoma cells towards these agents was determined by cytotoxicity assays. In accordance with the hypothesis that ALKBH2 would inhibit D-2-HG, a 1-hour treatment of cells with MMS at concentrations of 3-6 mM and an ensuing cell culturing over 48 hours resulted in a stronger response of IDH1-R132H-transfected glioblastoma cells. In contrast, continuous treatment of cells with MMS or TMZ over a period of 10 days did not show different responses in IDH1-Wt- compared to IDH1-R132H-transfected cells. Neither discontinuous nor continuous treatment of cells with MMS resulted in a different relative protein or mRNA expression of ALKBH2 in IDH1-Wt- and IDH1-R132H-transfected glioblastoma cells. In contrast to the results with IDH1-R132H-transfected glioblastoma cells, an increased sensitivity to cytostatic agents was not detected in glioblastoma cell lines with a TP53 mutation and/or expression of the DNA repair enzyme O6-Methylguanin DNA-methyl transferase (MGMT). The protein p53 is involved in the regulation of the enzyme ALKBH2. The missing indirect evidence of an impaired function of ALKBH2 in IDH1-R132H-transfected glioblastoma cells with a TP53 mutation suggests a disturbed regulation of the expression of ALKBH2 that is induced by the TP53 mutation and is independent of the mutation status of IDH1. The observation that exclusively MGMT-deficient glioblastoma cells with an IDH1-R132H-mutation reacted stronger to MMS suggests that MGMT is of predominant importance for the resistance of glioma cells to DNA-alkylating agents. The results of these experiments may imply that patients with glioblastomas that not only have a loss of MGMT expression by hypermethylation of the MGMT promotor but also a mutant TP53 and/or IDH1 gene take more benefit from therapy with temozolomide than patients without such mutations. This hypothesis fits with the clinical observation that gliomas with IDH1 mutations are more sensitive to chemotherapeutic agents than IDH1-wildtype gliomas. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 28.07.2021 | |||||||
| Dateien geändert am: | 28.07.2021 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 17.02.2021 | |||||||
| Datum der Promotion: | 10.06.2021 |
