Dokument: Speziesübergreifende Charakterisierung des CYP4B1-Enzyms in Hinblick auf die Substratumsetzung

Titel:	Speziesübergreifende Charakterisierung des CYP4B1-Enzyms in Hinblick auf die Substratumsetzung
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=56835
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20210719-111156-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Meyer, Anne Elisabeth [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,68 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 11.07.2021 / geändert 11.07.2021
Beitragende:	PD Dr. Hanenberg, Helmut [Gutachter] PD Dr. Mahotka, Csaba [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Die Cytochrom P450 Familie 4 ist eine der ältesten P450-Enzymfamilien und hat sich als ein essentieller Teil in der Steroidbiosynthese formiert. Unter diesen evolutionär stark konservierten Monooxygenasen ist das CYP4B1-Enzym aufgrund verschiedener Eigenschaften einzigartig: Bisher konnte für das native humane CYP4B1 keine katalytische Aktivität identifiziert werden, sodass es als „orphan P450“ Enzym eingestuft wird. Das scheinbare Fehlen der Aktivität des Enzyms wurde ursächlich auf den Austausch einer einzigen Aminosäure in der Meander-Region des Proteins zurückgeführt, wo das native humane CYP4B1 an Position 427 ein Serin aufweist, wohingegen alle anderen CYP4B1-Enzyme – und auch alle Mitglieder der CYP4-Familie in Säugetieren – an der entsprechenden Position ein Prolin besitzen. Im Gegensatz dazu ist die Klassifizierung des CYP4B1-Enzyms von anderen Säugetieren eindeutig: Hier agiert CYP4B1 an der Schnittstelle zwischen endo- und xenobiotischem Metabolismus. Neben der ω-Hydroxylierung ungesättigter Fettsäuren ist das CYP4B1 im Unterschied zu anderen Mitgliedern der CYP4-Familie auch in der Lage, die Bioaktivierung einer Reihe von Xenobiotika zu katalysieren. Aufgrund dieser unklaren Bedeutung des CYP4B1 für den Menschen sollte in dieser Arbeit die physiologische Rolle des Enzyms während der Evolution analysiert werden. Zu diesem Zweck wurden CYP4B1-Enzyme verschiedener Spezies in lentivirale Expressionsvektoren kloniert und stabil in menschlichen Leberzelllinien exprimiert. Ein besonderer Fokus meiner Untersuchungen waren vergleichende Aktivitätsmessungen der verschiedenen CYP4B1 Isoformen zur Umsetzung unterschiedlicher Substrate sowie Analysen zur Proteinstabilität. Mittels der lentiviralen Vektoren wurde eine stabile Expression der CYP4B1 Isoformen von Mensch, Kaninchen, Maus und Pferd in Zellen einer humanen Leberzelllinie erreicht, die eine geeignete zelluläre Umgebung für die Cytochrome bot. Die Enzymaktivität der verschiedenen Isoformen wurde indirekt, durch eine Giftung der beiden Xenobiotika 4-Ipomeanol und Perilla Keton mit nachfolgender Induktion der Apoptose der Zellen, gemessen. Western-Blot-Analysen zeigten, dass die CYP4B1 Isoformen stabil in den Zellen exprimiert wurden und eine direkte Korrelation zwischen der Proteinstabilität und der Enzymaktivität existiert. Interessanterweise ist das CYP4B1 des Schimpansen – obwohl stabil in den Zellen exprimiert – nicht dazu in der Lage, die beiden Xenobiotika umzusetzen. Es hat zwar ein Prolin statt Serin an der korrespondierenden Position 427, aber darüber hinaus auch weitere Veränderungen, die die CYP4B1 Enzymaktivität gegenüber diesen Substraten negativ beeinflussen. Durch Sequenzvergleiche zwischen dem CYP4B1 des modernen Menschen und dem des Denisova-Menschen wurde ein weiterer Aminosäureaustausch identifiziert, p.V70G, der im Kaninchen-CYP4B1-Enzym die Proteinaktivität und –stabilität negativ beeinflusste. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass während der Evolution der großen Affen und des Menschen unabhängig voneinander verschiedene genetische Veränderungen im CYP4B1 auftraten, die zu einer Verminderung der Enzymaktivität gegenüber Xenobiotika führten. Inwieweit der Aktivitätsverlust des Enzyms essentiell für die Evolution unserer Vorfahren war, müssen weitere Untersuchungen klären. The cytochrome P450 family 4 is one of the oldest P450 enzyme families and has emerged as an essential part of steroid biosynthesis. Among these evolutionary strongly conserved monooxygenases, the CYP4B1 enzyme is unique: So far, no catalytic activity has been identified for the native human CYP4B1, therefore being classified as an „orphan P450“ enzyme. The apparent lack of activity of the enzyme is predominantly due to the replacement of a single amino acid in the meander region of the protein; the native human CYP4B1 has a serine at position 427, whereas all other CYP4B1 enzymes – and also members of the CYP4 family in mammals – have a proline in the corresponding position. In contrast, the classification of CYP4B1 enzymes from other mammals is unambiguous: Here, CYP4B1 acts at the interface between endo- and xenobiotic metabolism. In addition to the ω-hydroxylation of unsaturated fatty acids and in contrast to other members of the CYP4 family, CYP4B1 is also able to catalyze the bioactivation of a number of xenobiotics. Due to this unclear role of the CYP4B1 enzyme for humans, my task here was to further analyze the physiological role of the enzyme during evolution. For this purpose, CYP4B1 enzymes of various species were cloned into lentiviral expression vectors and stably expressed in human liver cell lines. Special focuses of my investigations were comparative measurements of the activity of the different CYP4B1 isoforms for the processing of different substrates and analyses of the protein stability. Using the lentiviral vectors, stable expression of the CYP4B1 isoforms from humans, rabbits, mice and horses in human liver cells was achieved. This cell line provided a suitable cellular environment for expression of the cytochromes. The enzyme activity of the various isoforms was measured indirectly, through processing of the two xenobiotics 4-ipomeanol and perilla ketone and subsequent induction of apoptosis in the cells. Western blot analysis revealed that the CYP4B1 isoforms were stably expressed in the cells and that there was a direct correlation between protein stability and enzyme activity. Interestingly, the chimpanzee’s CYP4B1 enzyme – although stably expressed in the cells – is not able to convert the two xenobiotics. The chimpanzee enzyme carries a proline instead of a serine at the corresponding position 427, but there are also other changes in the protein that negatively affect the CYP4B1 enzyme activity towards these substances. Sequence comparisons between the CYP4B1 of modern humans and that of the Denisovans identified another amino acid exchange, p.V70G, which negatively influenced the protein activity and stability in the rabbit CYP4B1 enzyme. These results clearly demonstrated that during the evolution of the great apes and humans, different genetic changes occurred in CYP4B1 independently of one another, which all led to a decrease in the enzyme activity towards xenobiotics. To what extent the loss of activity of the enzyme was essential for the evolution of our ancestors must be clarified in further studies.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	19.07.2021
Dateien geändert am:	19.07.2021
Promotionsantrag am:	04.11.2020
Datum der Promotion:	06.07.2021