Dokument: Vergleichende Analyse der Empfindlichkeit verschiedener Stämme von T. gondii auf unterschiedliche antimikrobielle Effektormechanismen in vitro

Titel:	Vergleichende Analyse der Empfindlichkeit verschiedener Stämme von T. gondii auf unterschiedliche antimikrobielle Effektormechanismen in vitro
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=56825
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20210715-102813-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Waldheim, Sara [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 6,88 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 10.07.2021 / geändert 10.07.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Däubener, Walter [Gutachter] Prof. Dr. med. Adams, Ortwin [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazellulärer Parasit, der zur Familie der Apicomplexa gehört. Hauptübertragungswege für den Menschen, den Zwischenwirt, sind die Aufnahme von T. gondii Oozysten über die Faeces von Katzen sowie die Aufnahme von Gewebszysten über nicht ausreichend gegartes Fleisch. Bei Immunkompetenten verläuft die Primärinfektion meist asymptomatisch. Unter Immunsuppression kann es zur Reaktivierung einer latenten Infektion kommen. Eine Erstinfektion der Mutter während der Schwangerschaft kann zur vertikalen Transmission auf das Ungeborene und damit zum Auftreten schwerer Symptome wie Chorioretinitis, Taubheit und zerebralen Verkalkungen führen. In Europa und Nordamerika kommen hauptsächlich drei klonale Stämme des Parasiten vor. Bei simultaner Infektion des Endwirtes, der Katze, mit unterschiedlichen klonalen Stämmen entstehen durch sexuelle Rekombination atypische Genotypen, die von klonalen Linien abweichen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Empfindlichkeit typischer und atypischer T. gondii Stämme auf unterschiedliche antimikrobielle Effektormechanismen in murinen mesenchymalen Stromazellen (mMSC) untersucht. Diese weisen ein breites Spektrum an antimikrobiellen Effektormechanismen auf. Einer davon ist die Produktion reaktiver NO-Verbindungen durch die induzierbare NO-Synthase (iNOS). Reaktive NO-Verbindungen interagieren mit Enzymen des Parasiten und hemmen bzw. beeinflussen für den Parasiten relevante Stoffwechselvorgänge. Die Produktion reaktiver NO-Verbindungen führt zudem zur Depletion von Arginin, einer für den Parasiten essentiellen Aminosäure. Einen weiteren Effektormechanismus gegen T. gondii in mMSC stellen die sog. Immunity-related GTPases (IRG) dar. Als mögliche Mechanismen werden dabei beispielsweise eine Regulation der Parasitenphoren Vakuolen (PV) oder eine Beschleunigung der Abschnürung der PV diskutiert. Um die Bedeutung antiparasitärer Effektormechanismen gegen T. gondii in vitro zu analysieren, wurden mMSC mit Tachyzoiten unterschiedlicher T. gondii Stämme infiziert. Eine Stimulation von mMSC mit IFN-γ, TNF-α und IL-1β führte zu einer Hemmung des Wachstums sowohl klonaler als auch atypischer Stämme. Dieser inhibitorische Effekt auf das Parasitenwachstum ließ sich jedoch nur bei den hoch virulenten Klonen durch Zugabe des spezifischen iNOS-Inhibitors N-G-Monomethyl-L-Arginin (NGMMA) antagonisieren. Dies legt den Schluss nahe, dass in mMSC neben der iNOS ein weiterer IFN-γ-induzierter Effektormechanismus eine Rolle bei der T. gondii Abwehr spielt. Im Folgenden wurde die IFN-γ-induzierte Rekrutierung der GTPase Irgb6 zur PV atypischer T. gondii Klone mittels spezifischer Färbungen und konfokaler Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht. Nach Stimulation mit IFN-γ und Infektion mit einem Typ II Parasiten wurde bei der Mehrzahl der intrazellulären Parasiten eine Kolokalisation von Irgb6 und PV detektiert. Bei Infektion mit einem Typ I Parasiten zeigte sich nur eine schwache Kolokalisation. IFN-γ-induzierte GTPasen scheinen somit bei der Abwehr niedrig und mäßig virulenter Stämme eine größere Rolle zu spielen als bei der Abwehr hoch virulenter Parasiten. An Orten, an denen Inflammation stattfindet, besteht häufig eine relevante Hypoxie. Da viele antimikrobielle Effektormoleküle wie auch die iNOS Sauerstoff als Substrat benötigen, nimmt die Hypoxie Einfluss auf die Enzymaktivität. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die iNOS auch unter hypoxischen Bedingungen aktiv ist, verbunden jedoch mit einer geringeren NO-Produktion als unter Normoxie. mMSC konnten das Wachstum von T. gondii dennoch auch unter hypoxischen Kulturbedingungen inhibieren. Im Gegensatz zur Normoxie führte die Zugabe von NGMMA zu keinem signifikanten Anstieg des Parasitenwachstums. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass mMSC das Wachstum von T. gondii mithilfe der iNOS und der IRG hemmen können. Dieser Effekt existiert auch unter Hypoxie. Während das Wachstum von Typ II und III Parasiten nach alleiniger Stimulation mit IFN-γ gehemmt wird, ist bei Typ I Parasiten eine Kostimulation mit IFN-γ, TNF- und IL-1β erforderlich. Im Falle der untersuchten atypischen T. gondii Stämme konnte keine strikte Korrelation zwischen der Virulenz in Mäusen, der Ausprägung von bestimmten Virulenzfaktoren und der Sensitivität gegenüber den untersuchten induzierten Effektormechanismen gezeigt werden. Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that belongs to the Apicomplexa family. For humans serving as intermediate hosts, the main routes of transmission are the ingestion of T. gondii oocysts through the faeces of cats and the ingestion of tissue cysts through insufficiently cooked meat. In immunocompetent individuals, the primary infection is usually asymptomatic. A latent infection can be reactivated under immunosuppression. A primary maternal infection during pregnancy can lead to vertical transmission to the unborn child and thus to the appearance of severe symptoms such as chorioretinitis, deafness and cerebral calcifications. There are predominantly three clonal strains of the parasite found in Europe and North America. When the cat - serving as the ultimate host - is simultaneously infected with different clonal strains, sexual recombination results in atypical genotypes that deviate from clonal lines. In the present study the sensitivity of typical and atypical T. gondii strains to different antimicrobial effector mechanisms in murine mesenchymal stromal cells (mMSC) was examined. These show a broad spectrum of antimicrobial effector mechanisms. One of them is the production of reactive NO compounds by inducible NO synthase (iNOS). Reactive NO compounds interact with enzymes of the parasite and inhibit or influence metabolic processes that are relevant for the parasite. The production of reactive NO compounds also leads to the depletion of arginine, an amino acid that is essential for the parasite. Another effector mechanism against T. gondii in mMSC are the so-called immunity-related GTPases (IRG). Possible mechanisms that are discussed here are, for example, regulation of the parasite-containing vacuoles (PV) or an acceleration of the constriction of the PV. In order to analyze the importance of antiparasitic effector mechanisms against T. gondii in vitro, mMSC were infected with tachyzoites from different T. gondii strains. Stimulation of mMSC with IFN-γ, TNF- and IL-1β led to an inhibition of the growth of both clonal and atypical strains. However, this inhibitory effect on parasite growth could only be antagonized in the highly virulent clones by adding the specific iNOS inhibitor N-G-Monomethyl-L-Arginine (NGMMA). This suggests that in mMSC another IFN-γ-induced effector mechanism plays a role in T. gondii defense in addition on iNOS. Therefore, in the following the IFN-γ-induced recruitment of the GTPase Irgb6 to the PV of atypical T. gondii clones was examined by means of specific staining and confocal immunofluorescence microscopy. After stimulation with IFN-γ and infection with a type II parasite, a colocalization of Irgb6 and PV was detected in the majority of the intracellular parasites. Infection with a type I parasite showed only weak colocalization. IFN-γ-induced GTPases hence seem to play a more significant role in the defense against low and moderately virulent strains than in the defense against highly virulent parasites. Relevant hypoxia is often present in locations where inflammation occurs. Since many antimicrobial effector molecules, like the iNOS, require oxygen as a substrate, hypoxia influences the enzyme activity. In the present study it could be shown that the iNOS is also active under hypoxic conditions, but associated with a lower NO production than under normoxia. However, mMSC were able to inhibit the growth of T. gondii even under hypoxic culture conditions. In contrast to normoxia, adding NGMMA did not lead to a significant increase in parasite growth. In summary, it can be stated that mMSC can inhibit the growth of T. gondii with the help of iNOS and IRG. This effect also exists under hypoxia. While the growth of type II and III parasites is inhibited after stimulation with IFN-γ alone, type I parasites require co-stimulation with IFN-γ, TNF-α and IL-1β. In the case of the examined atypical T. gondii strains, no strict correlation could be shown between the virulence in mice, the expression of certain virulence factors, and the sensitivity to the examined induced effector mechanisms.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	15.07.2021
Dateien geändert am:	15.07.2021
Promotionsantrag am:	08.12.2020
Datum der Promotion:	08.07.2021