Dokument: Hepatische Differenzierung von humanen induziert pluripotenten Stammzellen mit unterschiedlichen CYP2D6 Varianten
| Titel: | Hepatische Differenzierung von humanen induziert pluripotenten Stammzellen mit unterschiedlichen CYP2D6 Varianten | |||||||
| Weiterer Titel: | Hepatic differentiation of human induced pluripotent stem cells with different CYP2D6 variants | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=56780 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20210708-085126-6 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Bielec, Kevin [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Adjaye, James [Gutachter] Prof. Dr. Küry, Patrick [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Das polymorph exprimierte Enzym Zytochrom P450 2D6 (CYP2D6) spielt eine zentrale Rolle bei der hepatischen Metabolisierung von 20-25% aller klinisch eingesetzten Medikamente, darunter >160 verschiedene Arzneimittel der wichtigsten Wirkstoffklassen wie z.B. trizyklische Antidepressiva, Opioide, Antiarrhythmika und β-Blocker. Seine genetische Variabilität führt jedoch zu erheblichen interindividuellen Unterschieden hinsichtlich erreichter wirksamer Blutspiegel eines Arzneimittels und somit seiner Sicherheit und Wirksamkeit. Da medikamenteninduzierte Leberschädigung (DILI) der häufigste Grund für den Rückzug von Arzneimitteln vom Markt ist, besitzt die Entwicklung eines zellbasierten In-vitro-Testsystems, das die Metabolisierung von Arzneimitteln und die hepatotoxischen Wirkungen von Kandidaten für neue Prüfpräparate (IND) angemessen widerspiegelt, enormes wissenschaftliches und wirtschaftliches Potenzial. Hiermit könnten unerwünschte Arzneimittelwirkungen (UAW) in frühen Stadien der Arzneimittelentwicklung aufgedeckt, die Notwendigkeit von Tierversuchen reduziert und letztlich die Sicherheit neuer Medikamente vor klinischer Applikation erhöht werden.
In dieser Studie wurden zwei induziert pluripotente Stammzelllinien (hiPSC) mit unterschiedlichen CYP2D6-Varianten unter Verwendung dreier verschiedener Matrix / Medium-Kombinationen in Hepatozyten-ähnliche Zellen (HLCs) differenziert. Nach dem dreistufigen Differenzierungs-protokoll, das eine physiologische Hepatogenese nachahmt, wurden die abgeleiteten HLCs auf ihre molekulare und biochemische Konstitution untersucht. Besonderes Augenmerk wurde auf die Expression von CYP2D6 gelegt. Die mittels quantitativer Echtzeit-PCR (qRT-PCR) gemessene Hochregulierung der Hepatozyten-assoziierten Genexpression (HNF4A, ALB, AFP, CYP3A4, CYP2D6) und Herunterregulierung des Pluripotenzmarkers OCT4 spiegelten die morphologischen Veränderungen wider, die während des Differenzierungsprozesses von hiPSC in HLCs beobachtet wurden. Die Expression hepatozytärer Biomarker wurde durch Immunfluoreszenzfärbung (HNF4a, E-Cadherin, AFP, ALB) und Durchflusszytometrie (HNF4A, AFP) auf Proteinlevel bestätigt. Metabolische Aktivität wurde durch Aufnahme und Freisetzung von Indozyaningrün (ICG) innerhalb von 24 Stunden nach der Anwendung, Durchführung einer PAS-Färbung zum Nachweis von Glykogenspeicherung, Nachweis der Harnstoffsekretion in Differenzierungsmedien und Messung der CYP3A4-Aktivität bei Stimulation mit 10 μM Rifampicin nachgewiesen. Die Immunfluoreszenzfärbung von CYP2D6 führte zu unerwarteten extrazellulären Färbesignalen, die Expression konnte jedoch durch Western-Blot-Analyse bestätigt werden. Beide hiPSC-Linien wurden erfolgreich in funktionelle HLCs differenziert, die ein typisches, eher fötales Hepatozyten-ähnliches Genexpressionsprofil und funktionelle Aktivität aufweisen. Die Matrix / Medien-Kombination von Laminin-Mix in Kombination mit einem supplimentierten Differenzierungsmedium auf Leibovitz-L15-Basis zeigte die robusteste Unterstützung der Leberdifferenzierung. Für alle Matrix / Medium-Kombinationen konnte eine Hochregulierung der II CYP2D6-Expression bestätigt werden, der Nachweis seiner ordnungsgemäßen Funktionalität lag jedoch außerhalb des Rahmens dieses Projekts. Für die Verwendung abgeleiteter HLCs als Teil eines In-vitro-Testsystems ist eine weitere Optimierung des Herstellungsprozesses erforderlich.The polymorphic enzyme Cytochrome P450 2D6 (CYP2D6) is predominantly involved in the hepatic metabolization of 20-25% of all clinically applied medication, including >160 different pharmaceuticals of major drug classes like tricyclic antidepressants, opioids, antiarrhythmics and β-blockers. Its genetic variability, however, results in substantial interindividual differences regarding effective blood levels of a given drug and, therefore, its safety and efficacy. For drug induced liver injury (DILI) being the most frequent reason of drug withdrawal from the market, the establishment of a cell-based in-vitro test system that adequately reflects drug metabolization and hepatotoxic effects of investigational new drug (IND) candidates imposes huge potential for indicating adverse drug reactions (ADR) at early stages of drug development, reducing the necessity of animal testing and increasing the patient’s safety. In this study, two induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines carrying different CYP2D6 variants were differentiated into hepatocyte-like cells (HLCs) using three different matrix/medium combinations. After undergoing the three-step differentiation protocol mimicking physiological hepatogenesis, the derived HLCs were assessed for their molecular and biochemical constitution. Special focus was laid on the expression of CYP2D6. Using quantitative real time PCR (qRT-PCR), upregulation of hepatocyte-associated gene expression (HNF4A, ALB, AFP, CYP3A4, CYP2D6) and downregulation of the pluripotency marker OCT4 reflected the morphological changes seen throughout the differentiation process from hiPSC into HLCs. Expression of the hepatocyte-associated biomarkers was confirmed by immunofluorescence staining (HNF4α, E-Cadherin, AFP, ALB) and flow cytometry (HNF4α, AFP). Metabolic activity of derived HLCs was proven by indocyanine green (ICG) uptake and release within 24 hours upon application, performing PAS staining for glycogen storage, detection of urea secretion into differentiation media and measuring CYP3A4 activity upon stimulation with 10 μM rifampicin. Immunofluorescence staining of CYP2D6 resulted in unexpected extracellular staining signals but expression could be confirmed by Western blot analysis. Both hiPSC lines were successfully differentiated into functional HLCs exhibiting a typical rather fetal hepatocyte-like gene expression profile and functional activity. The matrix/media combination of a Laminin-mix in combination with a growth-factor supplemented Leibovitz-L15-based differentiation medium indicated the most robust support of hepatic differentiation. For all matrix/medium combinations, upregulation of CYP2D6 expression could be confirmed but proving proper functionality was beyond the scope of this project. For using derived HLCs as part of an in-vitro testing system, further process development for producing a more mature cell type is necessary. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 08.07.2021 | |||||||
| Dateien geändert am: | 08.07.2021 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 01.02.2021 | |||||||
| Datum der Promotion: | 24.06.2021 |
